吲哚好氧轉(zhuǎn)化微生物群落結(jié)構(gòu)及功能基因解析.pdf

1、吲哚廣泛存在于自然界中，微生物、植物和動物代謝都能產(chǎn)生吲哚。研究表明吲哚是焦化廢水和畜牧業(yè)廢水中典型的氮雜環(huán)芳烴污染物，對人類健康和自然環(huán)境產(chǎn)生較大危害，吲哚的微生物轉(zhuǎn)化是該類廢水生物處理和資源化的關(guān)鍵。吲哚的生物轉(zhuǎn)化研究始于上世紀(jì)20年代，迄今仍存在微生物群落信息缺乏、降解菌資源有限且降解機制不明晰等問題。本論文從微生物群落、純菌特性及功能基因三個層面對吲哚好氧生物轉(zhuǎn)化過程進行系統(tǒng)研究，主要內(nèi)容及結(jié)論如下:
　　利用Illumi

2、na高通量測序技術(shù)解析吲哚好氧轉(zhuǎn)化的微生物群落信息，分別考察了實際焦化污泥和吲哚廢水反應(yīng)器污泥的微生物群落組成和結(jié)構(gòu)。實際焦化廢水處理廠活性污泥的微生物群落組成較為一致，主要菌屬包括Thiobacillus、Comamonas、Gp4、Azoarcus、Thauera、Kineosporia、Ensifer和Rhodoplanes。進一步構(gòu)建并運行兩種吲哚模擬廢水生物反應(yīng)器，分別為市政污泥體系（A體系）和焦化污泥體系（B體系）。兩個體系

3、都能有效去除吲哚并且生成靛藍(lán)類物質(zhì)。微生物群落分析表明，當(dāng)吲哚和葡萄糖共代謝時，Azoarcus和Thauera是污泥中的核心微生物，其在A和B體系中的相對豐度分別為37.94％和24.34％;當(dāng)吲哚為唯一碳源時，Alcaligenes和Comamonas演變成核心菌屬，其中Alcaligenes在B體系中的豐度高達(dá)49.41％，其他主要的菌屬還包括Burkholderia、Pseudomonas和Cupriavidus等。
　　

4、從吲哚馴化的微生物群落體系出發(fā)，利用微生物純培養(yǎng)技術(shù)獲取吲哚降解菌并考察其降解特性。通過吲哚馴化和反復(fù)平板涂布從反應(yīng)器污泥等樣品中篩選得到6株能以吲哚為唯一碳源生長的菌株，其中菌株Comomonas sp.IDO1、Comomonas sp.IDO2和Xenophilus sp.IDO4能在一周內(nèi)去除100 mg/L吲哚，菌株Burkholderia sp.IDO3、Cupriavidus sp.IDO和Cupriavidus sp.S

5、HE降解效率較高，能在24 h內(nèi)降解100 mg/L吲哚。選擇菌株Cupriavidus sp.SHE進行深入研究，高效液相色譜和質(zhì)譜分析表明菌株在吲哚無機鹽培養(yǎng)基中生長時，中間產(chǎn)物為靛紅、靛紅酸和鄰氨基苯甲酸。對菌株SHE進行全基因組和比較蛋白質(zhì)組解析，菌株共有6581個蛋白編碼序列，蛋白質(zhì)組檢測到1117個蛋白，其中118個蛋白顯著上調(diào)，59個蛋白顯著下調(diào)。上調(diào)變化的蛋白中有兩個基因簇（基因簇Ⅰ和Ⅱ），序列比對分析表明基因簇Ⅰ可能參

6、與吲哚氧化的過程，基因簇Ⅱ可能參與鄰氨基苯甲酸的代謝過程。
　　以吲哚降解菌株SHE的基因組和蛋白質(zhì)組信息為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)技術(shù)闡明菌株SHE降解吲哚機制。RT-qPCR實驗表明基因簇Ⅰ中she5651-she56544個基因在吲哚無機鹽培養(yǎng)基中均顯著上調(diào)表達(dá);利用同源重組技術(shù)成功得到基因敲除菌SHE-Δ5652和SHE-Δ5653Δ5654，敲除菌的吲哚降解能力顯著降低，且不能以吲哚為唯一碳源進行生長;對基因簇Ⅰ進行克隆實驗

7、，證實該基因簇能夠催化吲哚轉(zhuǎn)化，且she5652是負(fù)責(zé)吲哚氧化的功能基因，命名為indA。RT-qPCR實驗表明基因簇Ⅱ中she1808-she18146個基因在吲哚無機鹽培養(yǎng)基和鄰氨基苯甲酸無機鹽培養(yǎng)基中均顯著上調(diào)表達(dá);基因敲除菌SHE-Δ1814降解吲哚的能力和野生菌株SHE相似，但不能以吲哚和鄰氨基苯甲酸為唯一碳源生長;對基因she1810進行異源表達(dá)和酶學(xué)分析，產(chǎn)物分析顯示該蛋白能催化鄰氨基苯甲酸生成鄰氨基苯甲酸輔酶A。綜上分析

8、推測出菌株SHE降解吲哚的機制:吲哚首先在基因簇Ⅰ作用下被氧化，然后生成靛紅和鄰氨基苯甲酸，最后在基因簇Ⅱ作用下通過罕見的鄰氨基苯甲酸輔酶A途徑進一步降解。
　　以吲哚降解過程中的功能蛋白為研究對象，利用生物信息學(xué)和基因重組技術(shù)探究吲哚加氧酶特性和應(yīng)用。IndA與Pseudomonas菌株中傳統(tǒng)的苯乙烯單加氧酶StyA相似性為30％左右，與Rhodococcusopacus菌株中新型的苯乙烯單加氧酶StyA1和StyA2B相似性為

9、40-60％，在系統(tǒng)進化樹中屬于一個獨立的分支，該加氧酶在Cupriavidus、Acientobacter和Burkholderia等菌屬中廣泛存在。IndA能在FAD和NADH存在下催化吲哚反應(yīng)，在37℃和pH8.0的磷酸鉀緩沖溶液中催化活性最高，對吲哚的Km和kcat值分別為0.36±0.10 mmol/L和1.53±0.16 min-1，此外IndA還能催化一系列吲哚衍生物反應(yīng)生成色素類產(chǎn)物。將基因indAB(she5652-s