基于基因芯片對(duì)浸礦微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的定量化研究.pdf

1、我國(guó)礦產(chǎn)資源是以低品位多金屬?gòu)?fù)雜原生硫化礦為主，傳統(tǒng)選冶技術(shù)成本高，環(huán)境污染嚴(yán)重已經(jīng)不能滿足經(jīng)濟(jì)的需求，而微生物冶金通過利用以礦物為能源的微生物的作用，氧化分解礦物使金屬離子進(jìn)入溶液，進(jìn)一步分離、提取金屬具有成本低、流程短、設(shè)備簡(jiǎn)單、低污染等優(yōu)勢(shì)逐漸成為解決資源開發(fā)與環(huán)境保護(hù)矛盾的新途徑。
　　 但生物冶金過程存在浸出速度慢、浸出周期長(zhǎng)，對(duì)某些重金屬缺乏抗性的問題，特別是對(duì)于復(fù)雜低品位的原生硫化礦而言，需要有高氧化活性的微生物才

2、能破壞其晶格，而如何快速鑒別與篩選高效浸礦微生物成為解決生物冶金浸出速度慢、浸出率低這一難題的關(guān)鍵；另一方面，生物冶金過程的多樣性也決定了浸礦體系微生物種群與功能及其影響因素的復(fù)雜性，有效的浸礦微生物在浸礦體系中沒有高效表達(dá)。上述兩個(gè)難點(diǎn)是制約微生物冶金技術(shù)發(fā)展的瓶頸，因此，如何強(qiáng)化細(xì)菌浸出成為生物冶金發(fā)展的重要課題，需要用更新、更有力的生物技術(shù)來研究浸礦微生物本身特性。
　　 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacill

3、us ferrooxidans)是目前研究得最多的浸礦細(xì)菌，在礦堆、浸礦系統(tǒng)中普遍存在，好氧嗜酸，可以將Fe2+氧化成Fe3+，將還原態(tài)的硫氧化成SO42+，是生物冶金中最常用的菌種，也是完成全基因組序列測(cè)定的唯一浸礦細(xì)菌，這樣我們就可以在全基因組水平上對(duì)A.ferrooxidans進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究。
　　 本文首先基于TIGR公布的A.ferrooxidans ATCC23270全部序列信息共選得3217個(gè)寡聚核苷酸探針，挑

4、選人類基因和植物基因作為陰性對(duì)照或定量對(duì)照，并以A.f菌的基因組DNA作為陽性對(duì)照，設(shè)計(jì)了58mer寡核苷酸全基因組芯片，整個(gè)芯片包含3270個(gè)探針。我們還對(duì)此芯片進(jìn)行了評(píng)估，此芯片的雜交最佳溫度為45℃；檢測(cè)靈敏度為5ng，100ng時(shí)已經(jīng)達(dá)到飽和，且信號(hào)值與濃度之間具有很強(qiáng)的線性關(guān)系(r2=0.992)，可以作為定量判定的依據(jù)；沒有發(fā)現(xiàn)與非靶標(biāo)基因間的非特異性交互雜交現(xiàn)象，表明此寡核苷酸芯片具有良好的特異性。
　　 利用構(gòu)建

5、的全基因組芯片對(duì)不同浸礦活性的菌株進(jìn)行了基因?qū)用娴姆治?，?217個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)有967個(gè)基因?yàn)椴煌木晁赜?，其余?250個(gè)(70％)基因?yàn)樗蠥.f菌共有，可以作為是否是A.f菌的判據(jù)；另發(fā)現(xiàn)320個(gè)高氧化活性菌特征基因，在其中還找到135個(gè)與亞鐵和硫氧化以及抗性等功能有關(guān)的基因，這些基因作為A.f菌冶金性能好壞的判據(jù)。據(jù)此建立了“嗜酸氧化亞鐵硫桿菌及其活性的基因芯片檢測(cè)方法”國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T20929-2007)。
　　

6、 為了進(jìn)一步了解有效的浸礦微生物在浸礦體系中高效表達(dá)的途徑，本文基于我們已經(jīng)克隆和測(cè)序獲得的嗜酸性微生物序列和NCBI已知的相關(guān)序列設(shè)計(jì)了1194個(gè)50mer寡聚核苷酸探針，其中包括16S rRNA探針140個(gè)、功能基因探針1054個(gè)，這些功能基因探針的靶標(biāo)序列分別涉及到碳固定，氮代謝，硫代謝，鐵氧化，金屬抗性、電子傳遞)和外膜蛋白相關(guān)的功能基因，人類基因在芯片中用來作為陰性對(duì)照和定量對(duì)照。此外，基因芯片上所涉及的這些靶標(biāo)序列幾乎包含

7、目前在自然酸性環(huán)境和浸出系統(tǒng)中已知的27個(gè)屬和55種嗜酸性細(xì)菌的全部基因序列，能夠有效的分辨酸性生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的差異性。
　　 本文還使用基于16S rRNA基因的RFLP技術(shù)研究了AMD微生物群落的地理分布，以及使用第二代功能基芯片研究了其微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育和功能多樣性、組成和結(jié)構(gòu)；結(jié)果表明檢測(cè)的不同的AMD樣地其微生物群落無論在系統(tǒng)發(fā)育多樣性、功能多樣性還是組成和結(jié)構(gòu)上都不同，周圍的環(huán)境參數(shù)可能是造成這種現(xiàn)