基于生物芯片的高通量DNA分析方法及其應(yīng)用研究.pdf

1、DNA芯片是現(xiàn)代生物技術(shù)中重要的前沿技術(shù)之一。本論文從芯片的制備、探針設(shè)計、待測DNA模板制備和檢測方式等多種角度，提出一系列創(chuàng)新性方法，設(shè)計出新型的高通量DNA檢測微陣列芯片，并利用這些芯片開展了SNP檢測、腫瘤樣本的DNA甲基化研究、小量樣品的基因表達(dá)高精度平行性檢測以及對轉(zhuǎn)錄因子在全基因組范圍內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)的鑒定。具體研究內(nèi)容和成果如下：
　　 1、基于多聚丙烯酸修飾表面的PCR產(chǎn)物芯片及其在多樣本SNP檢測中的應(yīng)用

2、　　 本研究中采用多聚丙烯酸包被技術(shù)來改進(jìn)基于平面玻片的PCR產(chǎn)物的固定效率。在本方法中，用氨基修飾的引物擴(kuò)增待測的DNA片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)過簡單的乙醇沉淀后，通過機(jī)械手點(diǎn)樣到多聚丙烯酸包被的玻片上制備成PCR產(chǎn)物微陣列。通過與醛基包被表面比較，證實了多聚丙烯酸包被的表面具有很高的核酸固定能力，并且發(fā)現(xiàn)固定的PCR產(chǎn)物對沸水浴處理和NaOH處理均具有較高的穩(wěn)定性。應(yīng)用基于多聚丙烯酸表面的PCR產(chǎn)物芯片，分別用雜交、固相單堿基延伸和固相

3、多堿基延伸三種方法檢測了單核苷酸變化。我們用這種方法成功地對30個健康成年人外周血DNA樣品中Cytochrome P450 2D6基因的4個SNP位點(diǎn)進(jìn)行了分型。實驗結(jié)果表明，這種多聚丙烯酸包被的玻片對于粗制PCR產(chǎn)物可以獲得高的固定效率，能夠?qū)崿F(xiàn)高特異性和高信噪比的SNP分型，并且具有雜交效率高、背景熒光低和極少吸附熒光標(biāo)記探針以及能有效地進(jìn)行酶延伸反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。
　　 2、結(jié)合靶選擇鎖式探針(TSPP)通過芯片上單堿基延伸進(jìn)

4、行多重CpG甲基化檢測
　　 本研究運(yùn)用一套靶序列選擇鎖式探針(TSPP)實現(xiàn)了多個靶基因的并行性擴(kuò)增，采用多聚丙烯酸包被的玻片來制備甲基化分析芯片。TSPP探針通過其3’－和5’－末端的特異性序列與亞硫酸氫鹽處理后的基因組DNA上的特定靶序列雜交，并在3’－和5’－末端之間留出一段未雜交的30-100個堿基的靶序列，這段靶序列中含有多個待檢測的CpG位點(diǎn)。TSPP探針和亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA雜交后，以這段未雜交的靶序列為

5、模板，在DNA聚合酶的作用下延伸TSPP探針的3’－末端。當(dāng)TSPP探針的3’－末端延伸至探針的5’－末端時，在DNA連接酶的作用下填補(bǔ)缺口形成單鏈DNA環(huán)，然后用一對通用引物擴(kuò)增成環(huán)的TSPP探針從而實現(xiàn)了對多個靶基因區(qū)域的并行性擴(kuò)增。為了準(zhǔn)確地檢測多個靶位點(diǎn)的DNA甲基化，將擴(kuò)增產(chǎn)物和多聚丙烯酸修飾玻片上固定的寡核苷酸探針雜交，并用熒光標(biāo)記的底物Cy3-dCTP和Cy5-dUTP進(jìn)行固相的單堿基延伸(SBE)。利用多聚丙烯酸修飾表面

6、熒光背景低、DNA固定效率及雜交效率高的特點(diǎn)，提高了DNA甲基化芯片檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。實驗結(jié)果表明，本方法能夠?qū)崿F(xiàn)對多個目標(biāo)序列的并行性擴(kuò)增和對目標(biāo)序列中多個CpG位點(diǎn)甲基化的準(zhǔn)確檢測。
　　 3、利用乳液PCR和隨機(jī)微球微陣列技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)的數(shù)字化定量
　　 在本研究中我們將mRNA介導(dǎo)的連接、微乳液PCR和隨機(jī)微球微陣列等技術(shù)相結(jié)合發(fā)展了一種隨機(jī)高密度微陣列技術(shù)，用于單分子水平的mRNA定量分析方法(MLB)。

7、這種微陣列是將上百萬個由表面具有由單個靶分子擴(kuò)增而來的分子簇的微球固定到玻片表面制備而成。在靶基因的mRNA介導(dǎo)下應(yīng)用DNA連接酶把若干與各個靶基因mRNA互補(bǔ)的寡核苷酸探針對進(jìn)行連接，然后該連接產(chǎn)物在油－水微乳液中被擴(kuò)增到2.8微米磁性微球的表面。擴(kuò)增過的微球被固定在載玻片上形成高密度的隨機(jī)微球微陣列。通過使用熒光標(biāo)記的探針對每個微球上的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行解碼，并對每種已解碼的微球進(jìn)行計數(shù)，即可得出相應(yīng)基因的表達(dá)水平。我們比較和優(yōu)化了微乳液

8、PCR的反應(yīng)配比、反應(yīng)條件，并比較了不同微球的乳液PCR反應(yīng)，以及在玻片表面上的不同固定方法。用這種高密度的隨機(jī)微陣列實現(xiàn)了對小量樣本的基因表達(dá)的數(shù)字化檢測。應(yīng)用該技術(shù)我們檢測了人類白血病K562細(xì)胞在用PMA(phorbol 12-myristate 13- acetate)誘導(dǎo)向巨核細(xì)胞分化前后Klf4、Sox5和Gapdh基因的表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)在PMA處理的K562細(xì)胞KLF4的表達(dá)有明顯的上調(diào)；而與此相反，在PMA處理下Sox

9、5的表達(dá)顯著下調(diào)，并被real-time RT-PCR所證實。該研究表明該技術(shù)能夠提供準(zhǔn)確的表達(dá)分析，是一種具有高通量潛力的表達(dá)分析方法。
　　 4、用ChIP-Seq在全基因組范圍鑒定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)
　　 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術(shù)是能夠研究DNA-蛋白質(zhì)在活細(xì)胞狀態(tài)下結(jié)合情況的一種非常有用的技術(shù)。在本研究里，我們建立了ChIP-Seq技術(shù)平臺并成功地鑒定了轉(zhuǎn)錄因子EGR1在基因組范圍內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)。
　

10、　 在ChIP實驗的初步優(yōu)化方面，我們對ChIP技術(shù)進(jìn)行條件摸索和優(yōu)化以獲得高度特異的捕獲產(chǎn)物，為高通量測序提供高質(zhì)量模板。由于真核生物基因組非常復(fù)雜，細(xì)胞內(nèi)有各種各樣的蛋白質(zhì)，目標(biāo)蛋白的特異性捕獲成為ChIP實驗的關(guān)鍵。為了提高ChIP的特異性，我們用了2個不同的轉(zhuǎn)錄因子抗體(EGR1和STAT3)對ChIP的步驟及參數(shù)進(jìn)行實驗優(yōu)化。實驗中我們用這兩個轉(zhuǎn)錄因子的已知靶點(diǎn)作為正對照，比較了不同的捕獲磁珠，洗滌條件以及捕獲時間對富集特異

11、性的影響。同時我們也優(yōu)化了片段化染色質(zhì)時超聲的條件和ChjP DNA純化方法,獲得了高度特異性的ChIP產(chǎn)物。
　　 在SOLiD測序文庫的制備方面，標(biāo)準(zhǔn)的SOLiD文庫需要大量的DNA樣品(500ng-2μg)和多個步驟，而ChIP的產(chǎn)物的量通常是非常有限的(0.1-30ng)，因此需要對測序文庫的的制備進(jìn)行優(yōu)化。我們對各種步驟進(jìn)行了優(yōu)化，簡化了整個過程步驟，提高了DNA的收率，大大地減少了文庫所需的DNA量。
　　

12、檢測K562細(xì)胞系（白血?。┑谋磉_(dá)譜了解研究的轉(zhuǎn)錄因子在特定細(xì)胞狀態(tài)的表達(dá)以及其靶基因或控制目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因的基因表達(dá)狀態(tài)是非常重要的。白血病細(xì)胞系對于闡明控制系限定的造血細(xì)胞的分子機(jī)制是非常有價值。人類白血病細(xì)胞系——K562細(xì)胞是一個紅系白血病細(xì)胞系(erythroleukemia cell line)，它是巨核細(xì)胞(megakaryocytic cell)和紅系細(xì)胞(erythroid)的共同前體，它的分化被阻斷。在PMA處理下，K56

13、2細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)成巨核細(xì)胞，因此該細(xì)胞可以提供一個研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控的模式。在細(xì)胞分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子的激活或抑制對于造血細(xì)胞的發(fā)育起著重要的調(diào)控功能。由PMA誘導(dǎo)的EGR1基因表達(dá)的激活在多種細(xì)胞類型被觀察到。已有的研究表明EGR1的激活對于K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化是重要的。為了進(jìn)一步理解PMA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞的分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，我們也分析了K562細(xì)胞處理PMA前后的基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明有4428個基因的表達(dá)發(fā)生了變化（大于2倍

14、），其中2796個基因被上調(diào)，1632個基因被下調(diào)。這些差異表達(dá)的基因涉及到廣泛的分子功能。我們發(fā)現(xiàn)在PMA處理下，大部分已知的EGR1靶基因的表達(dá)發(fā)生了顯著的變化。我們也對那些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)許多調(diào)節(jié)造血發(fā)生的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)生了變化。我們的表達(dá)數(shù)據(jù)對全面理解白血病細(xì)胞的分子特征及造血細(xì)胞的分化的分子機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控提供了重要的基礎(chǔ)。
　　 用ChIP-sequencing在全基因組范圍鑒定EGR1的結(jié)合位點(diǎn)E

15、GR1是一個早期反應(yīng)因子，廣泛參與了各種細(xì)胞反應(yīng)。以前的研究表明EGR1在PMA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞的分化過程中起重要的作用。但是它的作用分子機(jī)制還沒有廣泛研究。我們用染色體免疫共沉淀技術(shù)和高通量測序平臺在基因組范圍鑒定了的EGR1結(jié)合DNA序列。我們得到了3.67M的可以唯一匹配到基因組的序列。我們用CisGonome軟件分析了數(shù)據(jù)，得到了14667個EGR1結(jié)合的富集峰。為了評估ChIP-Seq數(shù)據(jù)的可信度，我們隨機(jī)挑選了2

16、8個峰進(jìn)行ChIP-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)89％的峰是結(jié)合有EGR1。對32個已知的EGR1靶基因以及ChIP-chip數(shù)據(jù)進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)60％已知的靶基因和61％的ChIP-chip鑒定的靶點(diǎn)可以在我們的ChIP-Seq數(shù)據(jù)里發(fā)現(xiàn)。用所得到的富集峰里的序列，通過計算得到的Motif和已報道的高度一致。這14636個富集峰中，其中有71％的結(jié)合位點(diǎn)可以定位到6138個已有注釋的基因區(qū)及其擴(kuò)展的區(qū)域(轉(zhuǎn)錄起始上游(TSS) 10kb-轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)

17、下游(TSE) 10kb)。對富集峰定位發(fā)現(xiàn)37％EGR1的結(jié)合區(qū)域位于于內(nèi)含子區(qū)和17％位于TSS 2kb-TSS 200bp的啟動子區(qū)。對這6000多個靶基因進(jìn)行分子功能分類表明EGR1的靶基因涉及廣泛的分子功能，其中靶基因數(shù)目最多的一類是轉(zhuǎn)錄因子（695個）。另外，ChIP-Seq的結(jié)果也揭示有79個microRNA的啟動子區(qū)域也有EGR1的結(jié)合。EGR1結(jié)合于大量的這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子暗示著EGR1在PMA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞分化過程

18、中起到了重要的調(diào)控作用。我們還比較了PMA處理的K562細(xì)胞中EGR1結(jié)合基因的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)在PMA處理下920個EGR1的靶基因上調(diào)的和243個靶基因下調(diào)。特別值得注意的是在差異表達(dá)的EGR1的靶基因中有130個是轉(zhuǎn)錄因子。我們的研究揭示在PMA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞分化過程中EGR1及眾多的EGR1的靶基因的表達(dá)發(fā)生了變化，說明EGR1是這一過程的關(guān)鍵因子。我們的研究鑒定出上千個新的EGR1靶點(diǎn)，這種全基因組范圍的EGR1結(jié)合位點(diǎn)的鑒