基于生物芯片的高通量DNA分析方法及其應用研究.pdf

1、DNA芯片是現(xiàn)代生物技術中重要的前沿技術之一。本論文從芯片的制備、探針設計、待測DNA模板制備和檢測方式等多種角度，提出一系列創(chuàng)新性方法，設計出新型的高通量DNA檢測微陣列芯片，并利用這些芯片開展了SNP檢測、腫瘤樣本的DNA甲基化研究、小量樣品的基因表達高精度平行性檢測以及對轉錄因子在全基因組范圍內(nèi)的結合位點的鑒定。具體研究內(nèi)容和成果如下：
　　 1、基于多聚丙烯酸修飾表面的PCR產(chǎn)物芯片及其在多樣本SNP檢測中的應用

2、　　 本研究中采用多聚丙烯酸包被技術來改進基于平面玻片的PCR產(chǎn)物的固定效率。在本方法中，用氨基修飾的引物擴增待測的DNA片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)過簡單的乙醇沉淀后，通過機械手點樣到多聚丙烯酸包被的玻片上制備成PCR產(chǎn)物微陣列。通過與醛基包被表面比較，證實了多聚丙烯酸包被的表面具有很高的核酸固定能力，并且發(fā)現(xiàn)固定的PCR產(chǎn)物對沸水浴處理和NaOH處理均具有較高的穩(wěn)定性。應用基于多聚丙烯酸表面的PCR產(chǎn)物芯片，分別用雜交、固相單堿基延伸和固相

3、多堿基延伸三種方法檢測了單核苷酸變化。我們用這種方法成功地對30個健康成年人外周血DNA樣品中Cytochrome P450 2D6基因的4個SNP位點進行了分型。實驗結果表明，這種多聚丙烯酸包被的玻片對于粗制PCR產(chǎn)物可以獲得高的固定效率，能夠?qū)崿F(xiàn)高特異性和高信噪比的SNP分型，并且具有雜交效率高、背景熒光低和極少吸附熒光標記探針以及能有效地進行酶延伸反應等優(yōu)點。
　　 2、結合靶選擇鎖式探針(TSPP)通過芯片上單堿基延伸進

4、行多重CpG甲基化檢測
　　 本研究運用一套靶序列選擇鎖式探針(TSPP)實現(xiàn)了多個靶基因的并行性擴增，采用多聚丙烯酸包被的玻片來制備甲基化分析芯片。TSPP探針通過其3’－和5’－末端的特異性序列與亞硫酸氫鹽處理后的基因組DNA上的特定靶序列雜交，并在3’－和5’－末端之間留出一段未雜交的30-100個堿基的靶序列，這段靶序列中含有多個待檢測的CpG位點。TSPP探針和亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA雜交后，以這段未雜交的靶序列為

5、模板，在DNA聚合酶的作用下延伸TSPP探針的3’－末端。當TSPP探針的3’－末端延伸至探針的5’－末端時，在DNA連接酶的作用下填補缺口形成單鏈DNA環(huán)，然后用一對通用引物擴增成環(huán)的TSPP探針從而實現(xiàn)了對多個靶基因區(qū)域的并行性擴增。為了準確地檢測多個靶位點的DNA甲基化，將擴增產(chǎn)物和多聚丙烯酸修飾玻片上固定的寡核苷酸探針雜交，并用熒光標記的底物Cy3-dCTP和Cy5-dUTP進行固相的單堿基延伸(SBE)。利用多聚丙烯酸修飾表面

6、熒光背景低、DNA固定效率及雜交效率高的特點，提高了DNA甲基化芯片檢測的靈敏度和準確性。實驗結果表明，本方法能夠?qū)崿F(xiàn)對多個目標序列的并行性擴增和對目標序列中多個CpG位點甲基化的準確檢測。
　　 3、利用乳液PCR和隨機微球微陣列技術進行基因表達的數(shù)字化定量
　　 在本研究中我們將mRNA介導的連接、微乳液PCR和隨機微球微陣列等技術相結合發(fā)展了一種隨機高密度微陣列技術，用于單分子水平的mRNA定量分析方法(MLB)。

7、這種微陣列是將上百萬個由表面具有由單個靶分子擴增而來的分子簇的微球固定到玻片表面制備而成。在靶基因的mRNA介導下應用DNA連接酶把若干與各個靶基因mRNA互補的寡核苷酸探針對進行連接，然后該連接產(chǎn)物在油－水微乳液中被擴增到2.8微米磁性微球的表面。擴增過的微球被固定在載玻片上形成高密度的隨機微球微陣列。通過使用熒光標記的探針對每個微球上的擴增產(chǎn)物進行解碼，并對每種已解碼的微球進行計數(shù)，即可得出相應基因的表達水平。我們比較和優(yōu)化了微乳液

8、PCR的反應配比、反應條件，并比較了不同微球的乳液PCR反應，以及在玻片表面上的不同固定方法。用這種高密度的隨機微陣列實現(xiàn)了對小量樣本的基因表達的數(shù)字化檢測。應用該技術我們檢測了人類白血病K562細胞在用PMA(phorbol 12-myristate 13- acetate)誘導向巨核細胞分化前后Klf4、Sox5和Gapdh基因的表達水平。我們發(fā)現(xiàn)在PMA處理的K562細胞KLF4的表達有明顯的上調(diào)；而與此相反，在PMA處理下Sox

9、5的表達顯著下調(diào)，并被real-time RT-PCR所證實。該研究表明該技術能夠提供準確的表達分析，是一種具有高通量潛力的表達分析方法。
　　 4、用ChIP-Seq在全基因組范圍鑒定轉錄因子的結合位點
　　 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)技術是能夠研究DNA-蛋白質(zhì)在活細胞狀態(tài)下結合情況的一種非常有用的技術。在本研究里，我們建立了ChIP-Seq技術平臺并成功地鑒定了轉錄因子EGR1在基因組范圍內(nèi)的結合位點。
　

10、　 在ChIP實驗的初步優(yōu)化方面，我們對ChIP技術進行條件摸索和優(yōu)化以獲得高度特異的捕獲產(chǎn)物，為高通量測序提供高質(zhì)量模板。由于真核生物基因組非常復雜，細胞內(nèi)有各種各樣的蛋白質(zhì)，目標蛋白的特異性捕獲成為ChIP實驗的關鍵。為了提高ChIP的特異性，我們用了2個不同的轉錄因子抗體(EGR1和STAT3)對ChIP的步驟及參數(shù)進行實驗優(yōu)化。實驗中我們用這兩個轉錄因子的已知靶點作為正對照，比較了不同的捕獲磁珠，洗滌條件以及捕獲時間對富集特異

11、性的影響。同時我們也優(yōu)化了片段化染色質(zhì)時超聲的條件和ChjP DNA純化方法,獲得了高度特異性的ChIP產(chǎn)物。
　　 在SOLiD測序文庫的制備方面，標準的SOLiD文庫需要大量的DNA樣品(500ng-2μg)和多個步驟，而ChIP的產(chǎn)物的量通常是非常有限的(0.1-30ng)，因此需要對測序文庫的的制備進行優(yōu)化。我們對各種步驟進行了優(yōu)化，簡化了整個過程步驟，提高了DNA的收率，大大地減少了文庫所需的DNA量。
　　

12、檢測K562細胞系（白血病）的表達譜了解研究的轉錄因子在特定細胞狀態(tài)的表達以及其靶基因或控制目標轉錄因的基因表達狀態(tài)是非常重要的。白血病細胞系對于闡明控制系限定的造血細胞的分子機制是非常有價值。人類白血病細胞系——K562細胞是一個紅系白血病細胞系(erythroleukemia cell line)，它是巨核細胞(megakaryocytic cell)和紅系細胞(erythroid)的共同前體，它的分化被阻斷。在PMA處理下，K56

13、2細胞能夠被誘導成巨核細胞，因此該細胞可以提供一個研究轉錄調(diào)控的模式。在細胞分化過程中，轉錄因子的激活或抑制對于造血細胞的發(fā)育起著重要的調(diào)控功能。由PMA誘導的EGR1基因表達的激活在多種細胞類型被觀察到。已有的研究表明EGR1的激活對于K562細胞向巨核細胞分化是重要的。為了進一步理解PMA誘導的K562細胞的分化的轉錄調(diào)節(jié)機制，我們也分析了K562細胞處理PMA前后的基因表達的變化。結果表明有4428個基因的表達發(fā)生了變化（大于2倍

14、），其中2796個基因被上調(diào)，1632個基因被下調(diào)。這些差異表達的基因涉及到廣泛的分子功能。我們發(fā)現(xiàn)在PMA處理下，大部分已知的EGR1靶基因的表達發(fā)生了顯著的變化。我們也對那些差異表達的轉錄因子進行了分析，發(fā)現(xiàn)許多調(diào)節(jié)造血發(fā)生的轉錄因子的表達發(fā)生了變化。我們的表達數(shù)據(jù)對全面理解白血病細胞的分子特征及造血細胞的分化的分子機制和網(wǎng)絡調(diào)控提供了重要的基礎。
　　 用ChIP-sequencing在全基因組范圍鑒定EGR1的結合位點E

15、GR1是一個早期反應因子，廣泛參與了各種細胞反應。以前的研究表明EGR1在PMA誘導的K562細胞向巨核細胞的分化過程中起重要的作用。但是它的作用分子機制還沒有廣泛研究。我們用染色體免疫共沉淀技術和高通量測序平臺在基因組范圍鑒定了的EGR1結合DNA序列。我們得到了3.67M的可以唯一匹配到基因組的序列。我們用CisGonome軟件分析了數(shù)據(jù)，得到了14667個EGR1結合的富集峰。為了評估ChIP-Seq數(shù)據(jù)的可信度，我們隨機挑選了2

16、8個峰進行ChIP-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)89％的峰是結合有EGR1。對32個已知的EGR1靶基因以及ChIP-chip數(shù)據(jù)進行檢查，發(fā)現(xiàn)60％已知的靶基因和61％的ChIP-chip鑒定的靶點可以在我們的ChIP-Seq數(shù)據(jù)里發(fā)現(xiàn)。用所得到的富集峰里的序列，通過計算得到的Motif和已報道的高度一致。這14636個富集峰中，其中有71％的結合位點可以定位到6138個已有注釋的基因區(qū)及其擴展的區(qū)域(轉錄起始上游(TSS) 10kb-轉錄終止點

17、下游(TSE) 10kb)。對富集峰定位發(fā)現(xiàn)37％EGR1的結合區(qū)域位于于內(nèi)含子區(qū)和17％位于TSS 2kb-TSS 200bp的啟動子區(qū)。對這6000多個靶基因進行分子功能分類表明EGR1的靶基因涉及廣泛的分子功能，其中靶基因數(shù)目最多的一類是轉錄因子（695個）。另外，ChIP-Seq的結果也揭示有79個microRNA的啟動子區(qū)域也有EGR1的結合。EGR1結合于大量的這些轉錄調(diào)控因子暗示著EGR1在PMA誘導的K562細胞分化過程

18、中起到了重要的調(diào)控作用。我們還比較了PMA處理的K562細胞中EGR1結合基因的表達變化。發(fā)現(xiàn)在PMA處理下920個EGR1的靶基因上調(diào)的和243個靶基因下調(diào)。特別值得注意的是在差異表達的EGR1的靶基因中有130個是轉錄因子。我們的研究揭示在PMA誘導的K562細胞分化過程中EGR1及眾多的EGR1的靶基因的表達發(fā)生了變化，說明EGR1是這一過程的關鍵因子。我們的研究鑒定出上千個新的EGR1靶點，這種全基因組范圍的EGR1結合位點的鑒