雙鏈DNA芯片的制備及其應(yīng)用研究.pdf

1、本文以序列特異性的DNA結(jié)合蛋白為研究材料，提出了一系列的新型雙鏈DNA芯片，并用于DNA結(jié)合蛋白與靶標(biāo)DNA的相互作用研究。具體內(nèi)容如下： 1.雙鏈DNA芯片的制備提出了三種雙鏈DNA芯片的制備方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中指出：傳統(tǒng)的雙鏈DNA芯片的制備方法，先固定的單鏈DNA分子后，雜交一段短的DNA分子，然后以該片段為引物在片延伸為雙鏈DNA分子，由于在片復(fù)性效果不理想，影響了DNA聚合酶的延伸，芯片點(diǎn)陣一致性較差，且信號(hào)較弱；而我們

2、提出的三種單分子發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針，可以進(jìn)行自身復(fù)性形成延伸引物，探針的復(fù)性和空間定位效果好，更有利于研究DNA/蛋白質(zhì)的相互作用。 2.雙鏈DNA芯片的制備條件的優(yōu)化為了能夠更經(jīng)濟(jì)有效的制備雙鏈DNA芯片，首先對(duì)發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的設(shè)計(jì)進(jìn)行了一序列的優(yōu)化，包括發(fā)卡結(jié)構(gòu)探針的旁側(cè)序列、loop區(qū)堿基數(shù)以及回文互補(bǔ)堿基數(shù)的設(shè)計(jì)等。 3.內(nèi)切酶與DNA序列特異性的相互作用研究利用雙鏈DNA芯片同時(shí)對(duì)2種內(nèi)切酶與固定的雙鏈DNA探針進(jìn)行了

3、序列特異的酶切反應(yīng)。同時(shí)，我們研究了甲基化修飾的固定化雙鏈DNA探針，對(duì)其對(duì)應(yīng)內(nèi)切酶的酶切活性的影響。 4.rhNF-κBp50二聚體與DNA序列特異性的相互作用研究利用方法Ⅱ制備了包含NF-κBp50二聚體蛋白識(shí)別的野生型結(jié)合位點(diǎn)以及所有可能發(fā)生的單堿基突變的結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈DNA芯片。 5.rhNF-κBp50二聚體與單堿基錯(cuò)配DNA的相互作用研究研究DNA結(jié)合蛋白與含有不同單堿基錯(cuò)配的識(shí)別位點(diǎn)間的相互作用對(duì)于揭示蛋白

4、質(zhì)與DNA靶序列間的序列特異性結(jié)合的機(jī)理同樣也是非常有價(jià)值的。 6.基于雙鏈DNA芯片的NF-κB蛋白標(biāo)記檢測(cè)方法在雙鏈DNA芯片的應(yīng)用中，主要通過(guò)蛋白質(zhì)的直接熒光標(biāo)記或?qū)?yīng)抗體標(biāo)記的方法進(jìn)行檢測(cè)。 7.不同結(jié)構(gòu)的固定化雙鏈DNA探針核酸雜交性能的比較我們提出了一種雙鏈DNA探針檢測(cè)和核酸序列的方法，并比較三種不同結(jié)構(gòu)的固定化探針的核酸雜交能力。 8.固定化的雙鏈DNA探針結(jié)構(gòu)用于單堿基錯(cuò)配識(shí)別通過(guò)延長(zhǎng)SHP探針

5、的莖干區(qū)序列，我們發(fā)展了一種新的固定化雙鏈DNA探針用以單堿基錯(cuò)配識(shí)別。該探針的具體設(shè)計(jì)方法為：將SHP探針的莖干區(qū)全部置于雜交區(qū)的內(nèi)部，并將中間堿基設(shè)置一個(gè)錯(cuò)配識(shí)別位點(diǎn)。在一組正配和錯(cuò)配探針中，我們將正配堿基內(nèi)部(莖干區(qū))引入一個(gè)錯(cuò)配堿基用以提高正配探針的雜交效率，而錯(cuò)配探針的堿基不變，即莖干區(qū)仍為正配。通過(guò)在不同溫度和Mg2+濃度下的雜交實(shí)驗(yàn)，證明了這種新型的雙鏈DNA探針具有更強(qiáng)的單堿基錯(cuò)配識(shí)別能力。我們相信，這種雙鏈DNA探針同

6、樣也能適用于分子信標(biāo)的研究和應(yīng)用。 通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)研究表明，雙鏈DNA芯片作為一種高通量的研究手段，對(duì)于研究DNA/蛋白質(zhì)的相互作用，以及預(yù)測(cè)DNA結(jié)合蛋白潛在的結(jié)合位點(diǎn)是非常有幫助的。因而，我們可以預(yù)測(cè)，雙鏈DNA芯片將在以下兒個(gè)方面的具有潛在的應(yīng)用：(1)在全蛋白質(zhì)組的規(guī)模上對(duì)DNA結(jié)合蛋白進(jìn)行探測(cè)；(2)在全基因組范圍掃描DNA結(jié)合蛋白的不同結(jié)合位點(diǎn)；(3)了解DNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物中不同堿基和氨基酸之間的作用情況；(4)比較