體外特異識(shí)別雙鏈DNA的TALEs設(shè)計(jì)合成與初步應(yīng)用.pdf

1、目的：食源性致病菌污染是影響我國食品安全的最主要因素之一。本研究的總體目標(biāo)旨在以大腸桿菌O157等食源性致病菌的特異雙鏈DNA為靶標(biāo)分子，獲得高特異性雙鏈DNA結(jié)合蛋白，并為建立食源性致病菌快速檢測方法提供研究思路。分目標(biāo)是利用生物信息學(xué)技術(shù)得到特異的靶標(biāo)物質(zhì)的DNA序列，建立特異的TALEs DNA模板，通過大腸桿菌系統(tǒng)翻譯，獲得特異的高親和力的DNA結(jié)合蛋白，并且嘗試建立可行的實(shí)驗(yàn)室檢測方法，對(duì)TALEs體外識(shí)別的方法進(jìn)行有效探索。

2、
　　方法：1、應(yīng)用商業(yè)化產(chǎn)品與實(shí)驗(yàn)室結(jié)合的方法，先根據(jù)目的DNA構(gòu)建可用于體內(nèi)基因組敲除的TALENs，然后通過測序以及生物信息學(xué)的其他技術(shù)排除重復(fù)序列眾多的干擾，尋找到完整的TALENs基因，再鑒定發(fā)揮識(shí)別DNA功能的TALEs，最后通過特異引物的設(shè)計(jì)采用PCR的方法獲得特異TALEs的基因；2、通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，建立pET-22b-TALEs表達(dá)載體。先對(duì)其進(jìn)行小量的誘導(dǎo)表達(dá)，摸索實(shí)驗(yàn)條件。當(dāng)條件成熟后再對(duì)其進(jìn)行大量

3、誘導(dǎo)表達(dá)，最后實(shí)現(xiàn)TALEs蛋白的高效可溶性表達(dá)；3、通過金屬螯合層析技術(shù)，利用6×His標(biāo)簽可以與金屬離子鎳產(chǎn)生有生物選擇行的結(jié)合的特點(diǎn)，建立完備成熟的TALEs蛋白純化實(shí)驗(yàn)室程序；4、通過凝膠阻滯和SPR的方法證明TALEs在體外環(huán)境下與DNA的結(jié)合能力；5、通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)將目標(biāo)DNA連接到聚苯乙烯材料材料上，再通過TLAEs與DNA特異結(jié)合的原理，并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行一系列的探索優(yōu)化之后，初步實(shí)現(xiàn)基于ELISA的TALEs

4、檢測DNA的目的。
　　結(jié)果：1、成功的在獲得了TALEs蛋白的基因，長度約2100bp，并通過測序證明該序列正確可以正確翻譯；2、通過構(gòu)建的表達(dá)載體，成功的實(shí)現(xiàn)了TALEs蛋白的大量可溶性表達(dá)，并通過蛋白純化獲得了純度較高的含有6×His標(biāo)簽的目的蛋白；3、將生物素標(biāo)記的雙鏈DNA結(jié)合在金片上，將目的蛋白稀釋不同的梯度，利用SPR技術(shù)證明了TALEs在體外環(huán)境中可以結(jié)合雙鏈DNA。4、當(dāng)TALEs蛋白與完全匹配的DNA結(jié)合時(shí)，整

5、個(gè)DNA的分子量會(huì)變大，當(dāng)DNA存在錯(cuò)配時(shí)，這種結(jié)合就會(huì)減弱。因此采取了凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，通過調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件在瓊脂糖凝膠電泳中再次得到了TALEs體外結(jié)合DNA的結(jié)果；5、探索了基于ELISA法的TALEs結(jié)合DNA的實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)條件的調(diào)整初步實(shí)現(xiàn)了采用ELISA法的思路對(duì)體外目的DNA特異性檢測的目的。并通過統(tǒng)計(jì)分析得到差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05），與其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證。
　　結(jié)論：1、通過適當(dāng)理性設(shè)計(jì)，能夠在10天之內(nèi)成功獲