嗜肺軍團菌雙價DNA疫苗的初步研究.pdf

1、軍團病主要是由軍團菌引起的人、畜共患的急性細菌性呼吸道傳染病。病程進展快，病死率高，易暴發(fā)流行，老年人和免疫抑制患者易感。軍團病易流行的主要原因首先在于軍團菌廣泛存在于天然水和土壤中，且易在含鐵的管道內(nèi)繁殖，如自來水管、噴泉、容積式電熱水器、居民住宅樓頂水箱、空調(diào)系統(tǒng)冷卻塔水和養(yǎng)魚池等，人畜因吸入含軍團菌的氣溶膠而感染；其次，軍團菌是一種胞內(nèi)寄生菌，血清型眾多，而軍團病又沒有特異的臨床癥狀，常被臨床醫(yī)生所忽視，易造成誤診誤治，病死率高達

2、25％～50％。軍團病目前尚無有效的預防措施。因此，研究廣譜、高效、持久的疫苗成為迫切需要。 主要外膜蛋白基因mompS是軍團菌的高度保守序列，為各血清型所共有，具有屬的特異性，是防止軍團菌感染的主要保護性抗原基因。編碼鞭毛亞單位蛋白的FlaA基因是軍團菌的另一保守序列。已有研究表明mompS與FlaA所編碼的蛋白具有良好的免疫原性，可作為DNA疫苗的候選抗原。但采用單一抗原的DNA疫苗免疫原性弱于活疫苗，不易產(chǎn)生交叉免疫，而雙

3、價DNA疫苗不僅可增強DNA疫苗的免疫原性，還能刺激機體產(chǎn)生多重免疫保護力。因此，本研究以軍團菌雙價DNA疫苗為研究方向，以軍團菌mompS基因和FlaA基因為研究對象，首次成功構(gòu)建了軍團菌的兩種雙價DNA疫苗：完全融合的momps/FlaA 基因雙價DNA疫苗和通過一段柔性鏈(Linker)連接的mompS／linker／flaA雙價DNA疫苗，同時構(gòu)建了兩種相應的單價DNA疫苗：mompS基因DNA疫苗和flaA基因DNA疫

4、苗，并首次對這兩種雙價DNA疫苗與兩種單價DNA疫苗的免疫原性和免疫保護性進行了初步研究。該研究尚未見國內(nèi)外報道。本研究為開發(fā)安全、高效的軍團菌疫苗提供研究基礎(chǔ)和科學依據(jù)。 本研究共分四個部分： 第一部分：以嗜肺軍團菌Lpl型的基因組DNA為模板，通過PCR分別擴增獲得嗜肺軍團菌mompS基因和flaA基因，將mompS基因和flaA基因分別定向克隆到原核表達載體pucl8和pET32a(+)中，并經(jīng)IPTG誘導分別表達

5、MOMPS和FlaA蛋白；隨后構(gòu)建mompS／flaA完全融合基因和mompS／linker/flaA基因的原核表達重組質(zhì)粒，經(jīng)TPTG分別誘導表達出MOMPS／FIaA和MOMPS／Linker／FlaA融合蛋白。 第二部分：將mompS、flaA、mompS／flaA、mompS／linker/flaA定向克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)，構(gòu)建四種真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3．1-mompS，pcDNA3.1-fla

6、A、pcDNA3.1-mompS／flaA 和pcDNA3.1一mompS／linkerl/flaA，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，并用免疫熒光技術(shù)分別檢測到四種重組質(zhì)粒的瞬時表達，四種重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性細胞克隆分別用Western blot分析，結(jié)果顯示：四種重組質(zhì)粒均能表達相應分子量大小的蛋白。 第三部分：將構(gòu)建的四種重組質(zhì)粒免疫BALBc小鼠，進行體內(nèi)免疫原性的研究。檢測小鼠體內(nèi)抗原特異性抗體水平、脾淋巴細胞增殖活性

7、、IFN-γ的分泌量和CTL細胞殺傷活性等指標。結(jié)果表明：與pcDNA3.1對照組相比，四種重組質(zhì)粒均有較好的免疫原性，從刺激小鼠產(chǎn)生抗體滴度的水平上分析，mompS／linker／flaA雙價DNA疫苗的抗體滴度高于其它三組重組質(zhì)粒，而mompS／flαA雙價DNA疫苗的細胞免疫水平高于其它三組重組質(zhì)粒，mompS／linker／flaA雙價DNA疫苗的細胞免疫水平高于mompS單基因DNA疫苗和．flαA單基因DNA疫苗，mompS