嗜肺軍團(tuán)菌多位點(diǎn)序列分型及脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析.pdf

1、目的：研究嗜肺軍團(tuán)菌菌株間的分子特征，對(duì)不同地區(qū)來源的嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行分子分型研究，構(gòu)建本地區(qū)SBT(sequence-based typing)數(shù)據(jù)庫與DNA指紋圖譜庫，與國(guó)際SBT數(shù)據(jù)庫比對(duì)，了解本地區(qū)與國(guó)內(nèi)嗜肺軍團(tuán)菌分子進(jìn)化情況及親緣關(guān)系，為研究本菌的生物進(jìn)化和種群結(jié)構(gòu)的分析積累資料；于分析菌株之間的相關(guān)性，從而了解菌株的同源性，協(xié)助追蹤感染來源，還有助于識(shí)別散發(fā)病例的傳染源，可對(duì)已確認(rèn)的暴發(fā)疫情進(jìn)行傳染源的追蹤，從而有效預(yù)防疫情的

2、再次發(fā)生。
　　 方法：
　　 1.嗜肺軍團(tuán)菌SBT基因分型1.1 DNA提?。簩⒓?xì)菌加入到0.5ml滅菌水中，100℃煮沸8min，迅速冷卻，10000 r/min離心3min后，取上清液作為初始PCR擴(kuò)增的模板DNA。
　　 1.2 引物合成及PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化：合成7對(duì)引物，分別為嗜肺軍團(tuán)菌的7個(gè)等位基因flaA、pilE、asd、mip、mompS、proA、neuA。設(shè)置退火溫度范圍為50℃-60℃的

3、12個(gè)溫度梯度，優(yōu)化退火溫度。
　　 1.3 將PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序：經(jīng)毛細(xì)管電泳確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純度和濃度后，送上海生工進(jìn)行產(chǎn)物純化和測(cè)序。
　　 1.4 測(cè)序結(jié)果校對(duì)和序列拼接及在線提交到EWGLI數(shù)據(jù)庫：測(cè)序結(jié)果經(jīng)Chromas軟件校對(duì)、Clustal1.81拼接后分析并上傳到數(shù)據(jù)庫(http://www.hpa-bioinformatics.org.uk)進(jìn)行比對(duì)，得到對(duì)應(yīng)的等位基因號(hào)及ST型。
　　

4、 1.5 繪制種系進(jìn)化樹：將Clustal1.81拼接后的7個(gè)等位基因的片段共3424bp拼接后，做出neighbor-joining種系發(fā)生樹。并到SBT數(shù)據(jù)庫中收集國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的嗜肺軍團(tuán)菌ST圖譜，將結(jié)果用MEGA4.0.2軟件制作嗜肺軍團(tuán)菌種系進(jìn)化樹井進(jìn)行分析。
　　 2.嗜肺軍團(tuán)菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析2.1細(xì)菌的培養(yǎng)及濃度測(cè)定：取48h嗜肺軍團(tuán)菌的純培養(yǎng)物加入到1ml細(xì)胞懸浮液中，調(diào)整壁桌之為4.0個(gè)麥?zhǔn)蠁挝弧?br>　　

5、2.2 膠塊包埋：將菌懸液與等量的1％Seskem Gold:1％SDS混勻加入模具，室溫凝固制成膠塊。
　　 2.3 膠塊中細(xì)菌裂解：將膠塊放入細(xì)胞裂解液中裂解2h，用純水洗兩次膠塊，每次10min，用TE洗四次膠塊，每次15min。
　　 2.4 酶切：配制預(yù)酶切緩沖液平衡15min后，用AscⅠ酶切液酶切膠塊4h。
　　 2.5 電泳：將小膠塊放于梳子齒上，制備1％Seskem Gold，設(shè)置電泳參數(shù)進(jìn)行電

6、泳。
　　 2.6 圖像獲取2.7電泳圖像分析和結(jié)果聚類分析：所有菌株的PFGE圖像用BioMumerics(Version4.0)數(shù)據(jù)庫軟件處理，讀取數(shù)據(jù)后應(yīng)用統(tǒng)一的MarkerH9812進(jìn)行校準(zhǔn)后聚類分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.嗜肺軍團(tuán)菌SBT基因分型
　　 1.1 ST型分布：有1株嗜肺軍團(tuán)菌屬于一個(gè)新的序列型(ST)，有1株由于neuA基因缺失未能分型，有1株ST345型國(guó)內(nèi)沒有報(bào)道，國(guó)際上有

7、發(fā)現(xiàn)，其余均為ST1型。
　　 1.2 種系發(fā)生樹分析：ST（未分型）與其他菌株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與其他菌株分屬不同的種系，J1(ST new)與20094-6(ST345)親緣關(guān)系較近，屬于同一個(gè)種系。其余32株菌均為ST1型，是國(guó)內(nèi)環(huán)境來源的嗜肺軍團(tuán)菌優(yōu)勢(shì)菌株，且在我國(guó)長(zhǎng)期流行。
　　 2.嗜肺軍團(tuán)菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析
　　 2.1 電泳結(jié)果：電泳后可得到8條左右大小為40kb～700kb的電泳條帶；25株嗜肺

8、軍團(tuán)菌進(jìn)行限制性內(nèi)切酶AscⅠ酶切后，得到13個(gè)PFGE帶型，其中以SJZLP0006(7株)帶型為主，此帶型的菌株占分離菌株的28.0％．
　　 2.2 聚類分析結(jié)果：所有血清1型的菌株均聚類到一起，菌株間相似性系數(shù)為60～100％;血清2-14型的菌株均聚類到一起，菌株間相似性系數(shù)為80～100％（見表1）。同一血清型別的帶型差別相對(duì)較小，說明石家莊地區(qū)嗜肺軍團(tuán)菌基因組AscⅠ酶切位點(diǎn)的遺傳變異較小。
　　 結(jié)論：<