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文檔簡介
1、傳統(tǒng)環(huán)境微生物的研究主要是依賴于純培養(yǎng),不僅耗時費力,而且不能精確地反映環(huán)境菌群的生存狀況、組成和多樣性。為了不破壞微生物正常生理狀態(tài),方便而準確地檢測分析,發(fā)展了各種生物發(fā)光標記技術,lux酶基因標記技術就是其中一種。Lux基因可作為報告基因?qū)胧荏w微生物中,其編碼的熒光脂酶能催化生物發(fā)光反應發(fā)出蘭綠色光,具有可借助相關儀器迅速、及時檢測,甚至可用肉眼直接觀察到,可在自然狀態(tài)下研究微生物活性等優(yōu)點,從而只需通過對發(fā)光的檢測就可對微生物
2、在環(huán)境中的生長、活性、分布等進行實時在線監(jiān)測。因此,轉(zhuǎn)入發(fā)光基因的發(fā)光菌具有極大的應用前景,其在環(huán)境檢測中的應用研究受到廣泛關注。溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis,TGGE)是一種DNA指紋圖譜技術,可對長度一致但堿基序列不同的DNA片段進行有效分離。其被廣泛應用于各種微生物生態(tài)學研究,用于分析分子大小相同但序列不同的16S rDNA片段,根據(jù)不同細菌其核糖體小亞基基因可
3、變區(qū)堿基序列的不同,分析微生物群落結構的組成,目前已發(fā)展成為環(huán)境微生物群落結構分析研究的主要手段之一。甲苯(toluene)是苯系化合物中的一種,由于化學結構中含有苯環(huán),致使其化學性質(zhì)穩(wěn)定,在環(huán)境中長期滯留,對生物體有較強的急慢性甚至遺傳毒性的危害。近年來生物修復技術因具有投入低、治理效果好以及基本不產(chǎn)生副作用等優(yōu)點,已逐步被應用到甲苯污染物的治理工作中。但目前我國對于生物修復的研究多局限于降解菌的常規(guī)分析和污染物降解率的測定,缺乏對降
4、解菌投放后活性的檢測和對環(huán)境中微生物種群結構影響的分析。本實驗將生物標記和TGGE 兩種手段結合,同時檢測降解菌的生長、活性及其對環(huán)境中微生物種群結構的影響。 目的: 利用lux發(fā)光標記,跟蹤監(jiān)測馴化的甲苯降解菌在微宇宙中的生長狀況,并用TGGE技術分析甲苯生物修復過程中微宇宙(Microcosm)菌群結構的動態(tài)變化,以期為更加全面地評價生物修復效果提供科學依據(jù)。 方法: 本實驗室篩選的惡臭假單胞菌(Pseudomo
5、nas putida)菌株,用lux 發(fā)光標記并馴化后,投加到模擬甲苯污染微宇宙中,用頂空氣相色譜7d監(jiān)測甲苯降解情況,并進行平板計數(shù)發(fā)光菌數(shù)及用弱光儀監(jiān)測發(fā)光降解菌發(fā)光強度的變化,以了解馴化的降解菌在微宇宙的生長活性及甲苯降解作用。提取7d中微宇宙樣品的總DNA,用通用引物進行16S rDNA V3區(qū)擴增,對擴增產(chǎn)物進行溫度梯度凝膠電泳(temperaturegradient gel electrophoresis,TGGE)分析,通
6、過對比分析TGGE指紋圖譜的變化,揭示外源微生物對微宇宙細菌種群結構的影響。 結果: 1. LuxAB基因成功轉(zhuǎn)移到惡臭假單胞菌中,其轉(zhuǎn)移率為33%。經(jīng)過5次的轉(zhuǎn)菌傳代培養(yǎng),約數(shù)十代以后,其發(fā)光率保持在99%~100%,表明PBBR-lux 質(zhì)粒在惡臭假單胞菌中傳代穩(wěn)定并能穩(wěn)定表達。 2.被標記的惡臭假單胞菌菌落在培養(yǎng)平板上肉眼可見發(fā)光,并可用X 片感光拍照,菌液發(fā)光強度可用弱光儀檢測。 3.發(fā)光
7、標記檢測及發(fā)光菌落計數(shù)顯示,投加的外源菌在微宇宙中生長良好。 4.TGGE 顯示,原水樣中含有可利用甲苯生長的微生物,水樣+HDM+甲苯組中7d菌落計數(shù)及OD值檢測表明總菌群有旺盛生長,和投加了外源菌組中總菌群的生長情況相當。但氣相色譜結果顯示,水樣+HDM+甲苯組中7d甲苯降解率僅為40.2%,而投加外源馴化菌后,水樣+HDM+甲苯+馴化菌組7d降解率達到91.0%。 5.對微宇宙TGGE圖譜中的主要條帶進行回收、
8、重新擴增、克隆建庫、測序及序列分析可知,所采水樣中主要菌群有大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens),在高濃度甲苯環(huán)境中,土著菌群中大腸桿菌生長減弱,銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌生長旺盛,投加的外源菌對微宇宙甲苯環(huán)境中菌群結構變化的影響不大。
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