dna的瓊脂糖凝膠電泳

1、DNA的瓊脂糖凝膠電泳自1937年瑞典的Tiselius創(chuàng)造紙電泳以來，人們又創(chuàng)造了許多新的支持電泳的介質(zhì)，其中較為常見的是瓊脂糖及聚丙烯酰胺。普通瓊脂糖凝膠制膠容易，能分離的核酸片段長(zhǎng)度范圍廣（0.250kb）可以區(qū)分相差約100bp的DNA片段；聚丙烯酰胺凝膠電泳的分辨率（5bp）要高于瓊脂糖，但它能分離的核酸分子通常1kb，且制膠等的操作遠(yuǎn)比制備瓊脂糖凝膠來得麻煩。當(dāng)DNA分子相當(dāng)大，其雙螺旋的半徑超出凝膠的孔徑時(shí)，如果還用普通瓊

2、脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，則DNA可能跑不出膠孔。在這種情況下，應(yīng)選用脈沖凝膠電泳。脈沖凝膠電泳可以區(qū)分相差幾百kb的DNA片段。在本節(jié)中，我們主要介紹DNA的瓊脂糖凝膠電泳。用于分離RNA的瓊脂糖凝膠電泳，在膠的制備及所使用的緩沖液等方面與DNA有所不同，請(qǐng)參見相關(guān)的章節(jié)。瓊脂糖是從海藻中提取的線狀多聚物。加熱到90C左右，瓊脂糖即可熔化形成清亮透明的液體，澆在模板上冷卻后固化形成凝膠，其凝固點(diǎn)為4045C。瓊脂糖凝膠電泳是利用DNA分子

3、在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)達(dá)到分離DNA混合物的目的。DNA分子在堿性條件下（pH8.08.3），堿基幾乎不解離，而鏈上的磷酸基團(tuán)解離，所以整個(gè)DNA分子帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子遷移速度取決于分子本身的大小和構(gòu)型，DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。不同的核酸分子的電荷密度大致相同，因此對(duì)泳動(dòng)速度影響不大。在堿性條件下，單鏈DNA與等長(zhǎng)的雙鏈DNA的泳動(dòng)率大致相同。電泳裝置電泳裝置瓊脂糖凝膠電

4、泳現(xiàn)大多使用水平電泳槽。較之早先的垂直電泳槽，水平電泳槽在凝膠的制備上比較靈活，且可使用低濃度的凝膠。由于水平電泳槽的兩極是相通的，這樣正負(fù)極的緩沖液也不會(huì)因?yàn)殡娪緯r(shí)間久了而產(chǎn)生太大的差異。電泳緩沖液電泳緩沖液在電泳的過程中，H2O被解離，在陽(yáng)極產(chǎn)生H而在陰極產(chǎn)生OH，即陰極逐漸變堿而陽(yáng)極逐漸變酸。因此，當(dāng)帶電荷的分子通過支持物介質(zhì)時(shí)，需要使用緩沖液以維持電泳所需的pH值。核酸電泳最常采用的緩沖液有TAE（Tris，Aceticacid

5、EDTA）、TBE(TrisBicacidEDTA)兩種。由于這些緩沖液的pH是堿性的，這就使得整條DNA鏈上的磷酸骨架的凈電荷為負(fù)，從而在電泳時(shí)能向正極泳動(dòng)。1.50.23瓊脂糖凝膠中瓊脂糖凝膠中DNADNA的檢測(cè)的檢測(cè)核酸電泳中常用的染色劑是溴化乙錠（ethidiumbroe，EB）。用EB染色可以檢測(cè)到15ng雙鏈DNA帶。此外也可用SYBRGreenI或II染色。這兩種染色劑的靈敏度較EB高，SYBRGreenI及II分別為60

6、pg雙鏈DNA帶及5ng雙鏈DNA帶。EB亦可用于檢測(cè)單鏈DNA，只是與單鏈DNA的結(jié)合能力稍為弱些。EB可以嵌入堿基之間，從而增加熒光強(qiáng)度。EB與DNA的復(fù)合物可以用紫外線檢測(cè)。不同波長(zhǎng)的紫外線能為DNA或EB吸收，被吸收的能量再轉(zhuǎn)化為波長(zhǎng)590nm的可見光的發(fā)射出來。通常用水將EB配制成10mgml的貯存液。EB見光分解，所以應(yīng)在避光條件下保存。可以保存在棕色的或外頭包裹有鋁鉑的小瓶中。要獲得較好的觀察效果，最好是在電泳結(jié)束后用EB

7、對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行染色。其方法是在電泳結(jié)束后，將膠（制備膠時(shí)不加EB）取出，浸泡在濃度為0.5μgml的EB溶液中（此溶液可用蒸餾水，也可用電泳緩沖液配制），于室溫下染色20min。EB溶液需要沒過膠平面。另一種方法是在配制凝膠時(shí)加入EB，使其終濃度為0.5μgml。EB摻入DNA分子中，可以在電泳后直接觀察核酸的遷移情況。要注意：加入EB后，DNA分子的移動(dòng)速度降低約15%。上樣緩沖液上樣緩沖液上樣緩沖液在DNA電泳過程中起三種作用：1

8、）增加樣品的密度，使得DNA樣品能夠平穩(wěn)地加入樣品孔中；2）給樣品上色，便于點(diǎn)樣；3）上樣緩沖液中含可在電場(chǎng)中移動(dòng)的染料。這些染料在電場(chǎng)中以可以預(yù)測(cè)的速率移向正極，這就便于我們監(jiān)控電泳過程。溴酚蘭在瓊脂糖凝膠中的移動(dòng)速度約相當(dāng)于二甲苯青FF的2.2倍。溴酚蘭在0.5%～1.4%的瓊脂糖凝膠中的泳動(dòng)速度大約相當(dāng)于300bp的線性DNA的泳動(dòng)速度，而二甲苯青FF的泳動(dòng)速度相當(dāng)于4Kb的雙鏈線形DNA的泳動(dòng)速度。下面介紹幾種上樣緩沖液的配方（