微流控溫度梯度毛細管電泳DNA分析系統(tǒng)的建立及應用研究.pdf

1、腫瘤的發(fā)生是分子上逐步累積的多基因改變的過程，通過基因的篩查可以對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進行有效的診斷和預測，從而實現(xiàn)腫瘤的早期診斷和早期治療。單核苷酸構象多態(tài)性(Single—nucleotide polymorphisms，SNPs)/基因突變和DNA甲基化是最常見的遺傳學和表觀遺傳學改變形式，經常用作研究疾病的重要分子標志物。迄今DNA測序仍是分析檢測基因的金標準，然而其耗時長、價格昂貴等特點不適宜大樣本檢測。盡管目前已經出現(xiàn)多種檢測基

2、因突變和甲基化的方法，但仍需進一步提高檢測速度和準確性，并降低成本。 溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)技術是一種穩(wěn)定、高效的測序前基因突變篩查技術，利用不同構象的分子具有不同的50％解鏈溫度(Tm)來進行分離和檢測，其最大優(yōu)勢就是無需事先了解突變類型，只要其Tm值處于施加的溫度梯度范圍內，就能有效檢測已知和未知突變。但現(xiàn)階段傳統(tǒng)的TGGE技術中溫度梯度

3、形成系統(tǒng)復雜，重現(xiàn)性差，而且檢測靈敏度較低。 微全分析系統(tǒng)(Miniaturized total analysis systemsm，μTAS)是基于物理學、分析化學、生物學等多學科研究領域而發(fā)展起來的微生化分析工具，其目的是通過分析儀器的微型化和集成化，極大限度地把分析實驗室的功能轉移到便攜的分析設備中，因此又被稱為微流控芯片(microfluidic chip)或芯片實驗室(Lab on a chip，LOC)。微流控芯片具

4、有分析速度快，靈敏度高等優(yōu)勢，樣品消耗可降低至納升級，易于集成化自動化的特點更適用于對珍貴臨床試樣的大樣本分析，增加速度，減少污染。 微流控芯片電泳分析系統(tǒng)是在毛細管電泳基礎上發(fā)展起來的一種更為優(yōu)化的分析工具。其原理是以電場為驅動力，借助于離子或分子在電泳遷移或分配上的差異，從而實現(xiàn)對復雜試樣中多種組分的分離。由于芯片的微通道面積—體積比顯著增大，焦耳熱能很快向四周溢散，所以可施加平板凝膠電泳難以達到的高場強，從而實現(xiàn)對樣品的快

5、速、高效的分離檢測。 近年來大腸癌發(fā)病率迅速上升，而基因突變和DNA甲基化常發(fā)生在腫瘤早期，對大腸癌的早期診斷具有重要意義。本研究通過微流控溫度梯度毛細管電泳系統(tǒng)的建立可對大腸癌細胞系和各種臨床樣本中K—ras基因突變和p16基因啟動子甲基化進行快速高效檢測，為腫瘤相關基因的大規(guī)模篩查提供了更為切實有效的分析工具。 材料與方法： 一、微流控芯片TGCE基因突變檢測系統(tǒng)的建立 1、用標準光刻和濕法刻蝕技術在

6、玻璃基片上刻蝕出十字形微通道網絡，采用熱鍵合方法將其與蓋片進行封接，在微通道末端粘接儲液池，制成玻璃微流控芯片。搭建共聚焦型激光誘導熒光檢測裝置，設定電泳進樣及分離電壓。 2、基于傾斜式熱輻射溫度梯度形成系統(tǒng)的建立 將一程序控溫鋁塊放置于玻璃微流控芯片上，通過在芯片與鋁塊接觸面的上游邊緣放置一條絕緣絲線，則分離通道自上游向下游會因獲得的輻射熱逐漸增加而溫度逐漸升高，從而形成一個連續(xù)的溫度梯度。 3、四種具有不同片

7、段長度和較大Tm值范圍的點突變模式樣品分別在有效溫度梯度范圍為3.0cm的5℃溫度梯度(1.7℃cm—1)和10℃溫度梯度(3.3℃cm—1)下進行微流控芯片TGCE檢測。電泳有效分離距離為4.5cm，每次電泳分離時間少于7min。 二、微流控芯片TGCE檢測K—ras基因突變 1、微流控芯片TGCE檢測6種大腸癌細胞系K—ras基因突變。 2、根據(jù)密碼子12突變與否，分別按不同比例將野生型HT29和突變型SW4

8、80細胞進行混合培養(yǎng)：1:1，4：1，16：1，64：1，128：1，256：1，512：1，考察系統(tǒng)對突變型K—ras的檢出限。 3、對83例大腸癌患者石蠟切片進行檢測，考察微流控芯片TGCE的篩分系統(tǒng)與直接PCR產物測序相比對大腸癌的篩查是否有意義。 4、微流控芯片TGCE檢測20例大腸癌患者的腫瘤組織和糞便樣品中K—ras基因突變情況，與PCR產物測序法比較檢出率和符合率。 5、定量分析突變型比例

9、采用AutoCAD軟件獲得同源雙鏈和異源雙鏈下的峰面積后，計算異源雙鏈峰面積占總峰面積的百分比就可以得到突變型的比例，用克隆測序獲得的突變型比例對芯片檢測結果進行校正，獲得回歸方程。 三、基于微流控芯片TGCE基因甲基化檢測方法的建立 1、亞硫酸氫鹽—微流控芯片TGCE甲基化檢測系統(tǒng)的建立 利用亞硫酸氫鹽可特異性地將未甲基化的胞嘧啶修飾轉化為尿嘧啶(C→U)，而對甲基化的胞嘧啶無修飾作用的特點，將靶序列原來甲基化

10、位點的甲基化狀態(tài)差異轉化成了核苷酸點突變(C→T)，將能夠進行基因突變檢測的溫度梯度毛細管電泳(TGCE)應用到了甲基化檢測中。 2、檢測甲基化模式樣品 分別從具有不同p16基因啟動子甲基化模式的大腸癌細胞系獲得完全甲基化和非甲基化模式片段。通過甲基轉移酶修飾法和去甲基化法獲得多種具有不同甲基化位點的p16基因啟動子片段，分別與非甲基化片段以等比混合變性復性后，在5℃和10℃溫度梯度下進行微流控芯片TGCE檢測。復雜甲基

11、化樣品PCR產物直接變性復性在5℃和10℃溫度梯度下檢測。 3、微流控芯片TGCE檢測p16基因啟動子甲基化情況已知的4種大腸癌細胞系和未知的3種大腸癌細胞系的該基因甲基化狀態(tài)。 4、系統(tǒng)檢出限的考察 根據(jù)p16基因啟動子甲基化與否，將非甲基化HT29細胞系和甲基化SW480細胞系的PCR產物等比混合、變性復性后稀釋50倍、100倍、200倍、400倍和800倍進樣電泳檢測，確定系統(tǒng)對DNA分子的檢出限。分別按不

12、同比例將非甲基化LS174T細胞系和甲基化SW480細胞系的PCR擴增片段按下列比例進行混合：1:1，4：1，16：1，64：1，128：1，256：1和512：1，微流控芯片TGCE檢測確定其對甲基化片段的檢出限。 5、亞硫酸氫鹽—微流控芯片TGCE檢測20例大腸癌患者的腫瘤組織和配對糞便樣品的p16基因甲基化狀態(tài)。 結果： 一、微流控芯片TGCE基因突變檢測系統(tǒng)的建立 本研究以從4種單點突變質粒中擴增

13、出的具有較大變性溫度范圍的PCR產物作為實驗材料，首次將TGCE過程移植到微流控芯片上，建立了一種簡單、高效、低成本的快速檢測基因突變的分析技術平臺。該裝置在3cm的加熱區(qū)域內通過熱輻射差異形成了芯片分離通道內穩(wěn)定而重現(xiàn)性好的溫度梯度，并且隨著絲線直徑的變化，溫度梯度能夠在3—10℃的范圍內任意調節(jié)。應用該體系，實現(xiàn)了在最大10℃梯度(3.3℃cm—1)內對DNA點突變進行檢測，由于一般DNA片段的變性溫度都位于10℃梯度內，使得這一方

14、法應用于檢測未知突變成為可能，而不必知道具體的突變位置和突變類型。 二、微流控芯片TGCE檢測K—ras基因突變 基于傾斜式熱輻射的微流控芯片TGCE系統(tǒng)對基因突變檢測的有效性進一步通過檢測6種大腸癌細胞系K—ras基因突變得到了驗證。該系統(tǒng)對比例混合細胞中突變型K—ras的檢出限可達1/513。用克隆測序檢測的突變型K—ras比例對芯片電泳檢測的突變型比例進行校正，以從電泳結果計算精確的突變型比例，回歸方程為y=0.9

15、93x—1.387。對84例石蠟切片K—ras基因檢測結果顯示，微流控芯片TGCE的檢出率明顯高于PCR產物直接測序。結合臨床資料分析，當腫瘤位于直腸時，以及浸潤深度達全層時K—ras基因突變率顯著增加。對20例大腸癌腫瘤組織和配對糞便樣品進行微流控芯片檢測的結果顯示，K—ras基因突變的檢出率，以及糞便樣品與腫瘤組織中K—ras基因突變的符合率，均明顯高于PCR產物直接測序。 三、基于微流控芯片TGCE基因甲基化檢測方法的建立

16、 用亞硫酸氫鹽修飾法使基因甲基化的差異轉化為基因多點突變，建立了基因甲基化檢測的亞硫酸氫鹽—微流控溫度梯度毛細管電泳法(bisulfite—μTGCE)。分別在5℃和10℃溫度梯度下完成了具有1個、2個、5個、12個、30個和35個甲基化位點的甲基化模式樣品和復雜甲基化樣品的檢測。應用此方法，完成了7種大腸癌細胞系p16基因啟動子甲基化的檢測。該系統(tǒng)檢測靈敏度可達0.5ng/μl，對比例混合細胞中甲基化片段的檢出限可達1/257