嗜肺軍團(tuán)菌LAMP檢測(cè)方法的建立.pdf

1、[背景和目的]嗜肺軍團(tuán)菌是一種環(huán)境感染性致病菌,可引起嚴(yán)重的急性呼吸道傳染病,是非典型肺炎的重要病原體之一。該菌首先發(fā)現(xiàn)于1976年的美國(guó)一次軍人聚會(huì),故稱作軍團(tuán)菌。嗜肺軍團(tuán)菌由氣溶膠介導(dǎo)傳播,可引起暴發(fā)流行或散發(fā)病例。軍團(tuán)菌肺炎不會(huì)自然康復(fù),如不進(jìn)行及時(shí)治療,1-7天即可能死亡,流行致死率高達(dá)30％,散發(fā)致死率甚至高達(dá)80％。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,生活水平的不斷提高,城市建筑物越來(lái)越多地采用了集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng),它在給人們帶來(lái)舒適的同時(shí),

2、由于空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)本身設(shè)計(jì)、安裝、運(yùn)行管理、清潔等各環(huán)節(jié)存在的不合理,可能產(chǎn)生和加重空氣污染,造成空氣質(zhì)量下降,尤其是受到病原微生物污染而可能引發(fā)呼吸道傳染,已成為建筑物室內(nèi)空氣污染的主要來(lái)源之一.因此,軍團(tuán)菌病在公共衛(wèi)生上意義重大,倍受各方面的關(guān)注。
　　 嗜肺軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)法和血清學(xué)檢測(cè)敏感性低,據(jù)相關(guān)報(bào)道僅為25％-75％,需要較長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間,導(dǎo)致軍團(tuán)菌病較低的診斷率和較高的死亡率。現(xiàn)有的分子生物學(xué)檢測(cè)方法需要昂貴及精密的儀

3、器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員,不能適應(yīng)基層實(shí)驗(yàn)室及疫情現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)需求。本文旨在探索建立一種快速簡(jiǎn)便而且成本較低的嗜肺軍團(tuán)菌分子檢測(cè)方法,適用于基層實(shí)驗(yàn)室或檢疫口岸的快速檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近幾年來(lái)發(fā)展的一種新的核酸擴(kuò)增方法,該法在保持PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性和縮短了檢測(cè)時(shí)間;特別是它不需使用熱循環(huán)儀,在等溫條件下就能完成反應(yīng)

4、,且擴(kuò)增產(chǎn)物用肉眼能觀察,更便于推廣應(yīng)用。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]運(yùn)用LAMP設(shè)計(jì)一套引物特異性識(shí)別嗜肺軍團(tuán)菌毒力基因-mip基因的多個(gè)特殊區(qū)域,在等溫條件下,特異性地快速擴(kuò)增目的基因片段,并產(chǎn)生白色焦磷酸鹽沉淀,加入熒光染料后,可出現(xiàn)強(qiáng)熒光。針對(duì)18株嗜肺軍團(tuán)菌和5株其他細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè),并與普通PCR方法進(jìn)行比對(duì),驗(yàn)證該方法的特異性和靈敏度。
　　 [結(jié)果]嗜肺軍團(tuán)菌LAMP檢測(cè)在1小時(shí)左右即可完成,所有嗜肺軍團(tuán)菌均產(chǎn)生肉眼