嗜肺軍團菌效應(yīng)因子LidA對宿主Rab1的識別機制研究.pdf

1、嗜肺軍團菌可寄生于哺乳動物的巨噬細胞內(nèi)，在宿主體內(nèi)通過其特有的Dot/Icm分泌系統(tǒng)，分泌一系列效應(yīng)蛋白，俘獲宿主胞內(nèi)的ER-Golgi(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體)囊泡轉(zhuǎn)運途徑，形成可保護自身的寄生性囊泡LCV，從而幫助嗜肺軍團菌完成胞內(nèi)復(fù)制過程。
　　 嗜肺軍團菌LCV的成熟依賴于俘獲宿主Rab1蛋白，一種指導(dǎo)宿主ER-Golgi轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵因子。該過程由一種Dot/Icm效應(yīng)因子SidM完成，目前，關(guān)于SidM俘獲Rab1的分子機制已

2、了解的較為清楚，它是一種專一性俘獲Rab1的酶，兼具GDF和GEF活性。
　　 嗜肺軍團菌Dot/Icm系統(tǒng)的另一種重要的效應(yīng)因子LidA，在細菌俘獲ER來源囊泡過程中發(fā)揮了重要作用，LidA可協(xié)助SidM俘獲宿主胞內(nèi)的Rab1蛋白;基因敲除實驗證明，在保持LCV的完整性上，LidA具有比SidM更重要的功效。為了闡明LidA識別和俘獲宿主Rab1的具體分子機制，我們在體外分別表達純化了LidA核心的coiled-coil結(jié)構(gòu)域

3、與GDP-Rab1和GTP-Rab1蛋白的復(fù)合物蛋白，通過共結(jié)晶和X-射線衍射技術(shù)，同時得到了GDP-Rab1-LidA復(fù)合物和GTP-Rab1-LidA的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)。
　　 LidA-Rab1復(fù)合物以1∶1比例結(jié)合，呈現(xiàn)球狀的整體構(gòu)象，兩種蛋白結(jié)合非常緊密。在復(fù)合物中，LidA的coiled-coil結(jié)構(gòu)域整體呈現(xiàn)出酷似“手掌”的空間構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)中的7段α-螺旋形成的3對反向平行的coiled-coil，以及一段獨立的α

4、6和其下端的一組β-折疊，構(gòu)成了向外伸展的四個“手指”，將球狀的Rab1蛋白牢牢抓在“掌心”，兩者的結(jié)合面覆蓋了Rab1多達41％的表面積;Rab1則主要通過其保守的switch和interswitch區(qū)域以疏水作用和氫鍵、鹽橋等多種形勢和LidA相互結(jié)合。
　　 令人驚訝的是，通過結(jié)構(gòu)比較我們發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物中的GDP-Rab1，其折疊方式和GTP-Rab1幾乎完全一致，呈現(xiàn)出典型的活性開放的RabGTPase構(gòu)象。LidA的C端

5、區(qū)域通過與GDP-Rab1互作，可將其保守的switchⅠ和switchⅡ區(qū)域鎖定為活性開放的折疊方式。通過等溫滴定量熱法，我們發(fā)現(xiàn)LidA在體外對GDP-Rab1和GTP-Rab1具有幾乎相等的高親和力（KD值在nM級別），并驗證了LidAC端區(qū)域?qū)DP-Rab1的活性構(gòu)象的貢獻。我們還通過蛋白定點突變、凝膠過濾層析、蛋白親和檢測、質(zhì)譜分析等生物化學(xué)手段，闡明了LidA與Rab1的最小互作區(qū)域;發(fā)現(xiàn)LidA在核苷酸存在的情況下，可競

6、爭結(jié)合SidM-Rab1復(fù)合物中的Rab1;證明了被SidM共價修飾上AMP基團的Rab1，仍然保持著和LidA互作的能力;還證明了LidA不僅能與之前報道的Rab1、Rab6、Rab8發(fā)生互作，還能與Rab2、Rab4、Rab5、Rab7、Rab9、Rab11、Rab14、Rab18、Rab20、Rab22等其它十幾種Rab家族成員發(fā)生互作。
　　 以上實驗結(jié)果證明，LidA以一種特別的“手型”結(jié)構(gòu)識別多種的Rab成員，Lid