軍團(tuán)菌Ⅳ型效應(yīng)因子RidL的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、嚴(yán)重感染嗜肺型軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)后，可能會發(fā)展成軍團(tuán)菌病(Legionnaires' disease)。在嗜肺型軍團(tuán)菌通過內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞后，利用自身Icm/DotⅣ型分泌系統(tǒng)分泌RidL效應(yīng)蛋白分子。RidL定位于LCV囊泡膜上，通過與逆向運(yùn)輸復(fù)合物(Retromer complex)中的Vps29亞基相互作用，改變逆向運(yùn)輸復(fù)合物的功能，從而影響宿主的逆向膜泡運(yùn)輸通路，進(jìn)而利于細(xì)菌在LCV中繁殖

2、。然而RidL和Vps29詳細(xì)的相互作用方式以及RidL的調(diào)節(jié)機(jī)理都不清楚。
　　為了回答上述問題，本文利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)RidL(183-734)一段截短序列。經(jīng)過多個(gè)純化步驟，包括親和純化、離子交換層析、分子篩層析等，得到純度較高、性質(zhì)穩(wěn)定、均一且適合進(jìn)行晶體學(xué)研究的蛋白樣品，最終濃縮到20mg/ml。經(jīng)過初步篩選、后續(xù)優(yōu)化等多步探索和嘗試，本文得到了RidL(183-734)單個(gè)蛋白的晶體，經(jīng)過X衍射處理，nativ

3、e晶體可以得到分辨率達(dá)2.7(A)的數(shù)據(jù)。用代謝缺陷型菌株B834，我們表達(dá)并純化得到了RidL(183-734)硒代衍生物的蛋白，并優(yōu)化得到其晶體，其X衍射分辨率可達(dá)3.5(A)。native和硒代衍生物晶體經(jīng)初步晶體學(xué)分析可確定其空間群為C2。晶胞參數(shù)為:a，b，c((A)):259.64，78.394，70.07;α，β，γ(°):90.00，91.49，90.00。本文用分子、生化、結(jié)構(gòu)等方法，首次得到RidL晶體學(xué)數(shù)據(jù)，探索了