軍團菌寄生自由生活阿米巴的生態(tài)學(xué)研究.pdf

1、本課題選擇上海市4家醫(yī)院的中央空調(diào)冷卻水為研究對象，通過軍團菌和自由生活阿米巴的分離培養(yǎng)和兩者共培養(yǎng)的方法對外環(huán)境中軍團菌和自由生活阿米巴的分布進行流行病學(xué)研究，同時在實驗室條件下對兩者進行共培養(yǎng)，并觀察軍團菌在共培前后的改變。 本研究的目的是為了了解上述四家醫(yī)院軍團菌在中央空調(diào)冷卻水中的污染情況，和軍團菌與同環(huán)境中自由生活阿米巴分布上的關(guān)系，以及兩者之間在生態(tài)學(xué)上的關(guān)系。本研究還期望通過兩者的共培養(yǎng)來探討自由生活阿米巴對軍團菌

2、在傳播和表型上的影響。為我國軍團菌的預(yù)防和控制提供生態(tài)學(xué)的依據(jù)。本課題研究包括4部分： 一、軍團菌與同一空調(diào)水環(huán)境中自由生活阿米巴的分離 通過對中央空調(diào)冷卻水中軍團菌和自由生活阿米巴的分離，了解軍團菌的污染情況，描述兩者之間分布上的關(guān)系。本研究于上海市4家醫(yī)院的空調(diào)系統(tǒng)中采水樣，應(yīng)用分離培養(yǎng)的方法進行軍團菌和自由生活阿米巴的分離。軍團菌最終進行血清學(xué)分型。研究結(jié)果表明，中央空調(diào)冷卻水中軍團菌檢出率較高，達52．17％，型

3、別主要是嗜肺軍團菌9型，其次為1型，3型和6型。6～9月份各月檢出率各不相同，最低為33．3％，最高為70％，檢出率跟各月采樣時點前后氣溫的關(guān)系比較密切。自由生活阿米巴的檢出率69．56％。自由生活阿米巴陽性的水樣中分離出軍團菌的水樣為53．1％，阿米巴陰性水樣中分離出軍團菌的水樣為50％，兩者差異之間無統(tǒng)計學(xué)意義。冷卻水中阿米巴前后檢出的變化與軍團菌的變化之間表現(xiàn)出一定的一致性，變化一致的有10例，變化相反的僅有4例。 該部分

4、結(jié)果顯示，中央空調(diào)冷卻水中軍團菌污染相當(dāng)普遍。軍團菌在水中的分布與氣溫有一定的關(guān)系，與阿米巴的分布也有一定的相關(guān)性。 二、軍團菌與同一空調(diào)環(huán)境中分離到的自由生活阿米巴的共培養(yǎng)實驗 軍團菌與自由生活阿米巴分別分離自同一份水樣中，將兩者純化培養(yǎng)后，于實驗室條件下進行共培養(yǎng)。將共培養(yǎng)產(chǎn)物Gimenes染色后油鏡下觀察，并將產(chǎn)物于電鏡下觀察。共培養(yǎng)8h后，阿米巴胞內(nèi)空泡增加，個別阿米巴空泡內(nèi)可觀察到有軍團菌的出現(xiàn)。24h后可觀察

5、到阿米巴胞內(nèi)的軍團菌數(shù)量增加，大部分胞內(nèi)可觀察到軍團菌，阿米巴結(jié)構(gòu)仍保持完整。72～96h后，阿米巴變圓，數(shù)量減少，胞內(nèi)軍團菌成團存在，有阿米巴細胞體裂解，阿米巴殘骸周圍散布存在著大量軍團菌。計數(shù)顯示，共培養(yǎng)后阿米巴的數(shù)量明顯減少。電鏡照片同樣顯示了上述變化，阿米巴胞內(nèi)存在大量成熟的軍團菌菌體，可見到有二分裂形態(tài)的存在。并且在被吞噬入阿米巴胞內(nèi)的軍團菌周圍發(fā)現(xiàn)了年輪狀的層層環(huán)繞的膜結(jié)構(gòu)。 該實驗提示，同一環(huán)境中軍團菌可以在自由生

6、活阿米巴體內(nèi)存活，并進行分裂繁殖，兩者之間是寄生與被寄生的關(guān)系，條件合適的時候阿米巴的命運是被軍團菌裂解。另外，阿米巴吞噬軍團菌采用的是包括纏繞吞噬在內(nèi)的兩種或者多種吞噬方式。 三、軍團菌與自由生活阿米巴關(guān)系的探討 將軍團菌與阿米巴共培養(yǎng)，染色觀察共培養(yǎng)前后軍團菌形態(tài)上的改變，利用SDS-PAGE電泳考察軍團菌菌體蛋白的改變。不同溫度條件下共培養(yǎng)時，通過對阿米巴的計數(shù)來考察軍團菌對自由生活阿米巴作用的差別。 共培

7、養(yǎng)前后軍團菌形態(tài)上發(fā)生了改變，由原來的長絲狀的菌體轉(zhuǎn)變?yōu)槎虠U狀的菌體。實驗結(jié)果表明，該改變是在阿米巴體內(nèi)完成的，因為長絲狀的菌體也可以被阿米巴吞噬進入胞內(nèi)，而不是有選擇性的只吞食短小的菌體。 但是SDS—PAGE蛋白電泳并沒有顯示前后有新的蛋白產(chǎn)生或者有原有蛋白的減少。相同溫度下，對照組的阿米巴濃度較對照組高，進一步證實了，軍團菌對阿米巴的裂解作用。 另外，對照組不同溫度下的比較顯示，溫度越高阿米巴的濃度反而越低，這說明

8、阿米巴更適合在相對較低的溫度下生長。而共培養(yǎng)組也顯示出相同的趨勢，說明軍團菌在較高的溫度下(35℃)對阿米巴的裂解能力更強。 四、阿米巴活體微培養(yǎng)法的創(chuàng)建 為能觀察到活體吞噬的全過程，并闡明被吞噬微生物和自由生活阿米巴的消長過程，本實驗摸索出一種在普通光學(xué)顯微鏡油鏡下可連續(xù)觀察自由生活阿米巴活體形態(tài)及其運動過程的微量懸滴培養(yǎng)法。該方法可在油鏡下連續(xù)觀察不經(jīng)染色的滋養(yǎng)體各種活動以及吞噬異物的過程。滋養(yǎng)體形態(tài)伸展貼于蓋玻片上