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文檔簡介
1、目的:本文通過PCR擴(kuò)增特異信號標(biāo)簽,導(dǎo)入載體質(zhì)粒pC6,構(gòu)建信號標(biāo)簽誘變突變體文庫穿梭質(zhì)粒pC6RS;通過細(xì)菌結(jié)合配對時轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用,使特異信號標(biāo)簽隨機(jī)插入到嗜肺軍團(tuán)菌的基因組中,由此構(gòu)建嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號標(biāo)簽誘變突變體文庫,為篩選嗜肺軍團(tuán)菌血清10型毒力基因打下基礎(chǔ)。包括二部分:1、信號標(biāo)簽誘變突變體文庫穿梭質(zhì)粒構(gòu)建;2、嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號標(biāo)簽誘變突變體文庫的建立。 方法:實驗一:信號標(biāo)簽誘變突變體文庫穿梭質(zhì)
2、粒構(gòu)建通過PCR擴(kuò)增信號標(biāo)簽(signature tags,STs)片段,導(dǎo)入載體質(zhì)粒pC6,構(gòu)建重組質(zhì)粒:pC6RS,電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌CCll8中,從CCll8中提取重組質(zhì)粒pC6RS后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌s17-1中,獲得信號標(biāo)簽誘變突變體文庫穿梭質(zhì)粒。 實驗二:嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號標(biāo)簽誘變突變體文庫的建立含重組質(zhì)粒pC6RS的大腸桿菌s17-1與嗜肺軍團(tuán)菌L10結(jié)合配對,通過轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用,將特意信號標(biāo)簽片段隨機(jī)插入到
3、軍團(tuán)菌的基因組中,通過營養(yǎng)依賴和抗性篩選建立嗜肺軍團(tuán)菌血清lO型信號標(biāo)簽誘變突變體文庫。 結(jié)果:實驗一:信號標(biāo)簽誘變突變體文庫穿梭質(zhì)粒構(gòu)建通過PCR 擴(kuò)增信號標(biāo)簽(signature tags,STs)片段,導(dǎo)入載體pC6,構(gòu)建重組質(zhì)粒pC6RS,電穿孔轉(zhuǎn)化到大腸桿菌CCll8中,從CCll8中提取重組質(zhì)粒pC6RS后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌s17-1中,獲得信號標(biāo)簽誘變突變體文庫穿梭質(zhì)粒。經(jīng)過PCR、核苷酸序列測定鑒定,成功地構(gòu)建了pC
4、6RS質(zhì)粒。 實驗二:嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號標(biāo)簽誘變突變體文庫的建立 經(jīng)過大腸桿菌S17-1與嗜肺軍團(tuán)菌血清10型的結(jié)合配對,通過轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用,將特異信號標(biāo)簽片段隨機(jī)插入到軍團(tuán)菌的染色體上,經(jīng)篩選后建立嗜肺軍團(tuán)菌血清10型信號標(biāo)簽誘變突變體文庫。經(jīng)過PCR擴(kuò)增及酶切鑒定,在構(gòu)建的信號標(biāo)簽誘變突變體文庫中,信號標(biāo)簽已成功插入到軍團(tuán)菌的基因組中。 結(jié)論:本研究用含特異性信號標(biāo)簽的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化供體菌后再與受體菌-嗜肺軍團(tuán)
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