基于SYBR GreenⅠ的雙鏈DNA定量方法.pdf

1、靈敏、準(zhǔn)確的雙鏈DNA(dsDNA)定量方法在生物學(xué)研究及應(yīng)用領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用，尤其對微量DNA定量時，如定量腫瘤患者血漿游離循環(huán)DNA(freecirculatingDNA)，法醫(yī)取證DNA及用于亞克隆的DNA片斷等，定量方法的靈敏度及準(zhǔn)確度均需達(dá)到較高的標(biāo)準(zhǔn)。紫外分光光度法是目前使用較多的DNA定量方法，此方法操作簡便，成本低，但不能區(qū)分雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈DNA(ssDNA)、RNA及單核苷酸，易受到鹽離子濃度、p

2、H及DNA提取試劑殘留的影響。熒光定量法是一種靈敏的DNA定量方法，將熒光染料與dsDNA結(jié)合，利用熒光分光光度計采集結(jié)合后增強(qiáng)的熒光信號，通過DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品所制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品DNA的初始濃度。本研究基于SYBRGreenI熒光發(fā)光原理，利用實時熒光定量PCR儀特有的四色熒光檢測通道及熒光信號采集系統(tǒng)，加入ROX作為校正染料，通過與紫外分光光度法進(jìn)行比較，分析定量過程的影響因素，通過熒光斑點(diǎn)染色法進(jìn)行驗證，以達(dá)到建立一種高精度，

3、高通量的雙鏈DNA定量方法的目的。本論文主要研究內(nèi)容如下： 一、SYBRGreenIdsDNA定量方法的建立將梯度稀釋的已知濃度λDNA與等體積的SYBRGreenI充分混合，設(shè)定參數(shù)，建立運(yùn)行程序，利用熒光定量PCR儀采集熒光信號，以ROX作為校正染料進(jìn)行定量分析。SYBRGreenI熒光定量法在0.015-2ng/μl濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(R2=0.9996)，檢測限可達(dá)0.015ng/μl。此方法檢測范圍不受生物樣本DN

4、A含量或生物樣本量的限制，可以滿足微量DNA定量要求，為分子生物學(xué)研究及臨床檢驗等多個領(lǐng)域提供了一種可靠的dsDNA定量方法。 二、SYBRGreenI熒光定量法與紫外分光光度法比較將λDNA.進(jìn)行2倍系列稀釋，濃度范圍為0.03～256ng/μl；將酶解法制備的小鼠腦組織基因組DNA粗提物進(jìn)行2倍系列稀釋，以λDNA為標(biāo)準(zhǔn)曲線；稀釋好的DNA樣品用SYBRGreenⅠ熒光定量法進(jìn)行定量，紫外分光光度計平行讀數(shù)，比較兩種定量方

5、法的靈敏度與準(zhǔn)確度。SYBRGreenⅠ熒光定量法比紫外分光光度法靈敏100倍以上，并可準(zhǔn)確定量低純度的DNA樣品；SYBRgreenⅠ熒光定量法可在組織均漿液中進(jìn)行基因組DNA定量，并實現(xiàn)在同一份生物樣本中進(jìn)行DNA定量及總RNA提取，為miRNA表達(dá)水平單細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化方法研究奠定基礎(chǔ)。 三、SYBRGreenⅠ熒光定量的影響因素將λDNA梯度稀釋樣品進(jìn)行一系列變性后復(fù)性及酶切處理，分析DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及DNA片斷長度對

6、熒光SYBRGreenⅠ熒光定量的影響，并利用SYBRGreenⅠ熒光斑點(diǎn)染色進(jìn)行驗證。酶切后的λDNA與完整的λDNA熒光定量結(jié)果無顯著差異；對λDNA梯度稀釋樣品分別在加入染料前后進(jìn)行一系列溫度處理后，兩種處理方法的定量結(jié)果在30-65℃范圍內(nèi)無顯著變化，隨著溫度的上升，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率均呈下降趨勢，當(dāng)進(jìn)行95℃變性復(fù)性處理時，兩種處理方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別下降98.4％與46.8％，SYBRGreenI斑點(diǎn)染色驗證結(jié)果與熒光定量結(jié)果基