一種基于HMBS SYBR Green--qPCR的鳥類DNA內(nèi)源性內(nèi)部控制系統(tǒng)的建立及應(yīng)用.pdf

1、靜燃生碩士學(xué)位論文(全目制學(xué)術(shù)學(xué)位)學(xué)號—M15—0699密級——一種基于HMBSSYBRGreen—qPCR的鳥類DNA內(nèi)源性內(nèi)部控制系統(tǒng)的建立及應(yīng)用王瑤瑤指導(dǎo)教師姓名：至盛盟塾撞：塹劌盤莖：蘭蒸塹型：22三QQ2申請學(xué)位級別：塑學(xué)科專業(yè)名稱：亟墮簦匡鱟論文提交日期：2Q!魚主壘旦論文答辯日期：2Q!魚生魚旦學(xué)位授予單位：塹；!：!i盤鱟學(xué)位授予日期：2Q!魚生互旦答辯委員會主席：旦壘鹽研究量2018年6月2碩士學(xué)位論文江蘇省10％，

2、湖北省16％，西藏0％；江蘇省粘菌素耐藥基因mcr—J陽性檢出率最高為762％，其次為云南省757％，福建省328％，山東省34％，湖北省0％，西藏O％。HMBSSYBRGreen—qPCR方法監(jiān)測結(jié)果表明：山東、江蘇、云南三個省份樣本中的HMBS基因的陽性率均為100％，HMBS基因的平均拷貝數(shù)分別為10515士o97[8D]／swab、10459土035[SDJ／swab和10457土o49[8D]／swab，相比較，來自湖北、福建

3、省和西藏的樣品中分別有2個、15個和11個未檢測到HMBS基因，HMBS基因的平均拷貝數(shù)分別為10359士o39[8D]／swab、10384土069isD]／swab和10301士111[sDl／swab，因此，不同采樣者的采樣方式會影響采集樣本核酸的質(zhì)量，進(jìn)而影響病原體和耐藥基因的檢出率。本研究所建立的內(nèi)部控制系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確的監(jiān)測鳥類臨床樣本中核酸的質(zhì)量，篩選出不合格的樣品，顯著地降低了PCR檢測的假陰性率。3一種基于HMBSSYBR

4、GreenqPCR的鳥類DNA內(nèi)源性內(nèi)部控制系統(tǒng)的驗證為了證明該系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確的監(jiān)測樣本中核酸的質(zhì)量，在本項研究中，用禽流感病毒感染20只SPF雞，采用三種采樣方法(充分、適中、輕微)采集咽喉拭子，采集的拭子樣本保存在三種保護(hù)液(DNA／RNA核酸穩(wěn)定劑、1xPBS、四種抗生素混合液)中，另外，將這些樣品分別置于室溫(0天，3天和9天)，隨后對所有樣本進(jìn)行HMBSSYBRGreen—qPCR檢測，以及禽流感病毒的PCR檢測。試驗結(jié)果表明：

5、1)充分采集的樣本HMBS基因檢測結(jié)果均為陽性，H9N2AIV檢測出的陽性率為90％。2)適中和輕微采集樣本的HMBS基因的陽性率為分別為50％和20％，H9N2AIV檢測出的陽性率分別為50％矛D0％。在三種樣本保護(hù)液中，DNA／RNA核酸穩(wěn)定劑的效果最好，室溫儲存9天內(nèi)對樣本中H9N2AIV的檢出率無影響，樣本在另外兩種保護(hù)液中室溫儲存3天或3天以上，對樣本核酸質(zhì)量和病原體陽性檢出率的影響差異性顯著。實驗證明：采樣方法、樣品保護(hù)液和