一種基于HMBS FRET-qPCR的哺乳動物DNA內(nèi)源性內(nèi)部控制系統(tǒng)的建立及應用.pdf

1、垂篁董!二登墨主旦竺堡墨￡墮!旦￡墾墾盟墮塾墊塑型壘凼塑絲塑塑蕉型墨墊笪壟皇墾墮旦I一種基于HMBSFRETqPCR的哺乳動物DNA內(nèi)源性內(nèi)部控制系統(tǒng)的建立及應用中文摘要聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction，PCR)作為一種特異靈敏的分子診斷工具，被廣泛應用于生命科學研究的各個領(lǐng)域。然而從樣品采集、運輸、保存、核酸提取到PCR檢測的整個過程中都可能存在一些因素，影響被檢核酸的質(zhì)量和水平，造成檢測結(jié)果的假陽性或假

2、陰性。為提高PCR檢測結(jié)果的可信度，非常有必要建立一種內(nèi)源性內(nèi)部控制(endogenousinternalcontrol，EIC)系統(tǒng)，實現(xiàn)從樣品采集到PCR檢測的全程質(zhì)量監(jiān)控。在本論文的研究一，我們設(shè)計了一套針對哺乳動物羥甲基膽色烷合成酶(hydroxymethylbilanesynthase，HMBS)基因的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET)定量PCR(quantit

3、ativePCR，qPCR)的EIC系統(tǒng)。在研究二及研究三，應用建立的EIC作為質(zhì)量控制系統(tǒng)，保證分子檢測結(jié)果的準確度和可信性，從而開展對哥斯達黎加和尼加拉瓜的七種蟲媒疾病的分子流行病學調(diào)查。本研究建立的EIC系統(tǒng)可擴增人和12種哺乳動物(犬、貓、牛、小鼠、豬、驢、馬、猴子、綿羊、山羊、獅子、獵豹)、小鼠的11種組織或臟器(心、肝、腦、脾、肺、脂肪、腎、肌肉、毛發(fā)、骨、皮膚)的DNA。此方法也可方便地用于蚊子的吸血體積及對應血液的宿主來

4、源的判定。蚊子樣本PCR擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研宄采集的蚊子吸取了6種哺乳動物的血液。本系統(tǒng)的靈敏度高(005ng組織或05n1血液／反應體系)、特異性好，并可區(qū)別不同的哺乳動物物種，因此可成為哺乳動物核酸PCR檢測的理想EIC系統(tǒng)，同時也是研究吸血節(jié)肢動物的有用工具。蟲媒疾病為熱帶地區(qū)犬發(fā)病和死亡的重要原因，但是關(guān)于這類疾病在中美洲地區(qū)的流行信息卻十分有限。本研究應用了FRETqPCR檢測犬的全血核酸樣本，調(diào)查七種蟲媒疾病在尼加拉

5、瓜和哥斯達黎加犬中的流行情況。在尼加拉瓜，犬全血核酸樣本(n=39)攜帶有5種病原體：貓立克次體(陽性率5％)、巴貝斯蟲(26％)、犬肝簇蟲(51％)、扁平無漿體(13％)、犬埃立克次體(56％)，而貝納柯克斯體及犬心絲蟲的檢測結(jié)果為陰性。其中共有30只犬(80％)檢測結(jié)果為陽性，12只(3l％)攜帶一種病原體，11只(28％)攜帶兩種病原體，3只(8％)攜帶三種病原體，4只(10％)攜帶四種病原體。在哥靳達黎加，犬全血核酸樣本(n=4

6、0)中沒有檢測到貓立克次體及貝納柯克斯體的核酸，但另外5種蟲媒疾病病原體的檢測結(jié)果分別為：犬心絲蟲(陽性率225％)、犬肝簇蟲(375％)、巴貝斯蟲(25％)、扁平無漿體(75％)、犬埃立克次體(50％)。9只犬魚墮董!二壁莖堅叢旦￡墮!：堡￡墾墾盟墮塾墊塑旦塑壘墮塑堡凼壑堡型墨塹塑壅皇墾墮旦IIIUseofauniversalhydroxymethylbilanesynthase(HMBS)basedFRETqPCRasanendog

7、enousinternalcontrolformammalianDNAsanditsapplicationAbstractAsaspecificandsensitivemoleculardetectiontool，thepolymemsechainreaction(PCR)hasbeenwidelyusedonbiologicalresearchareasworldwideHowever，itiswellknownthatmanyfac

8、torscanadverselyinfluencethequantityandqualityofDNAandresultinfalsepositivityornegativityduringthewholeprocessofsamplecollection，transportation，conservation，DNAextractionandPCRdetectionTherefore，thereisanurgentneedtodeve

9、lelopanendogenousinternalcontrol(EIC)systemfordynamicmonitoringofthequalityandquantityofDNAsforPCRsInstudyoneofthisthesis，wedesignedandvalidatedafluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)quantitativePCR(qPCR)targetingthem

10、ammalianhomologofthehydroxymethylbilanesynthase(HMBS)geneasanEICforPCRsonmammalsInstudiestwoandthree，E1CwasappliedtomonitorthequalityandquantityoftestedDNAsduringthemolecularepidemiologicalinvestigationofsevenvectorborne

11、diseasesindogsfromNicaraguaandCostaRicaThedesignedEICcoulddetectwholebloodofhumanandother12mammalianspecies(dog，cat，cattle，mouse，pig，donkey，horse，monkey，sheep，goat，lionandcheetah)collectedfrom8countriesandtheHMBSgenein11

12、murineorgans／tissues(heart，liver，brain，spleen，lung，adipose，kidney，muscle，hair，honeandskin)Itwasalsousedconvenientlyonmosquitoestodeterminethevolumesofmammalianbloodmeals，anddeterminethemammalianspeciesfromwhichwholeblood

13、wasobtainedSequencingofampliconsobtainedfrommosquitoesinthisinvestigationrevealedtheyhadingestedbloodfromsixmammals，TheFRETqPCRprovedhighlysensitive(onegenecopyinO05ngtissueor05nlwholeblood／reaction)andspecificwithnofals

14、enegativeorpositiveresultsThehighsensitivityandspecificityoftheFRET—qPCRanditsabilitytodifferentiatemammalianspeciesmakesitanidealEICforPCRsinvolvingmammalsandausefultoolforhematophagousinsectstudiesThoughvector—bornedis