一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)甲型流感病毒方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、流感病毒基于其核蛋白抗原的多樣性，分為甲(A)型、乙(B)型、丙(C)型，其中甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)具有廣泛的宿主譜;抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換導(dǎo)致新IAV血清亞型和變異株不斷出現(xiàn)，甚至產(chǎn)生高致病性強(qiáng)毒株，并且可能跨越物種障礙進(jìn)而感染人類，造成局部地區(qū)乃至世界范圍流感疫情的暴發(fā)。因此，IAV不同血清亞型和變異株的快速檢測(cè)對(duì)甲型流感的防控具有重要意義。目前IAV檢測(cè)方法主要有病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷技術(shù)。

2、其中病原學(xué)方法耗時(shí)費(fèi)力;血清學(xué)方法特異性較低，容易出現(xiàn)交叉反應(yīng);分子生物學(xué)診斷技術(shù)敏感性和特異性較強(qiáng)，但多為兩步法，且不能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)IAV血清亞型。因此，本研究主要是建立一種快速靈敏，可檢測(cè)所有常見(jiàn)IAV血清亞型的方法，并且成功地應(yīng)用于我國(guó)活禽市場(chǎng)家禽的IAV檢測(cè)。
　　一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)甲型流感病毒方法的建立
　　本研究主要是基于68個(gè)IAV血清亞型的基質(zhì)蛋白(M)基因，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立一種一步反

3、轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)IAV的方法（PCR產(chǎn)物169 bp）。將特異性引物和探針進(jìn)行BLAST檢索，證實(shí)與IAV血清亞型高度匹配的有122個(gè)，包含28，206個(gè)IAV序列。應(yīng)用該方法對(duì)H1N1血清亞型病毒株制備的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，表明其靈敏度達(dá)到10拷貝/反應(yīng);對(duì)9株IAV血清亞型病毒株(H1N1、H3N3、H4N6、H5N1、H6N1、H7N9、H9N2、H10N8、H11N2)的敏感性檢測(cè)，表明該方法優(yōu)于傳統(tǒng)的雞胚半數(shù)感染量(EI

4、D50)測(cè)定方法。此外，本試驗(yàn)采集SPF雞的咽喉和泄殖腔拭子，加入不同稀釋度的H9N2，分別用于一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法和EID50試驗(yàn);并建立基于IAV聚合酶蛋白(PA)基因的反轉(zhuǎn)錄PCR方法(575 bp)，對(duì)一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)的陽(yáng)性樣品進(jìn)行驗(yàn)證。本研究建立的方法快速靈敏，可同時(shí)檢測(cè)出所有常見(jiàn)IAV血清亞型，為甲型流感疫情的監(jiān)測(cè)和防控提供重要技術(shù)支撐。
　　一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)甲型流感病毒方法

5、的應(yīng)用
　　從我國(guó)24省的活禽市場(chǎng)采集1，839只家禽（雞1，521只、鴨127只、鵝100只、鴿子91只）的咽喉和泄殖腔拭子樣品，應(yīng)用本研究建立的一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法進(jìn)行IAV檢測(cè)。結(jié)果表明，家禽IAV的陽(yáng)性率為9.2％(169/1，839)，其中雞的IAV陽(yáng)性率最高(10.4％;158/1，521)，其次是鴨(5.5％;7/127)，鴿子(4.4％;4/91)，鵝(0％;0/100);咽喉拭子的IAV陽(yáng)性率(7.5

6、％;138/1，839)顯著高于泄殖腔拭子的IAV陽(yáng)性率(5.2％;95/1，839;P＜10.4)，同時(shí)咽喉拭子含有的IAV拷貝數(shù)也明顯高于泄殖腔拭子(106.07 Vs.105.54;P＜104);咽喉和泄殖腔拭子均為陽(yáng)性的家禽占總陽(yáng)性家禽的27.8％(47/169)，僅咽喉拭子為陽(yáng)性的家禽占47.9％(81/169)，僅泄殖腔拭子為陽(yáng)性的家禽占24.3％(41/169)。
　　應(yīng)用基于PA、血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)

7、基因的PCR方法，進(jìn)一步對(duì)反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR檢測(cè)的陽(yáng)性樣品進(jìn)行IAV血清亞型判定。結(jié)果表明，在IAV陽(yáng)性家禽樣品中，H9N2血清亞型占56.8％(96/169)，H7N9血清亞型占41.4％(70/169)，H5N1血清亞型占1.8％(3/169)。H9N2血清亞型的家禽包括雞(95.8％;92/96)和鴨(4.2％;4/96)，在96個(gè)H9N2血清亞型的家禽中，咽喉和泄殖腔拭子均為H9N2血清亞型的家禽占9.3％(9/96)，僅

8、咽喉拭子為H9N2血清亞型的家禽占71.9％(69/96)，僅泄殖腔拭子為H9N2血清亞型的家禽占18.8％(18/96); H7N9血清亞型的家禽包括雞(94.3％;66/70)和鴿子(5.7％;4/70)，在70個(gè)H7N9血清亞型的家禽中，咽喉和泄殖腔拭子均為H7N9血清亞型的家禽占51.4％(36/70)，僅咽喉拭子為H7N9血清亞型的家禽占15.7％(11/70)，僅泄殖腔拭子為H7N9血清亞型的家禽占32.9％(23/70);

9、 H5N1血清亞型僅在鴨中檢出(n=3)，其中2只的咽喉和泄殖腔拭子均為H5N1血清亞型，1只僅咽喉拭子為H5N1血清亞型。
　　綜上所述，本研究建立了基于M基因檢測(cè)IAV血清亞型的一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法，并通過(guò)基于PA、HA和NA基因的反轉(zhuǎn)錄PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)用該方法對(duì)我國(guó)24省的活禽市場(chǎng)中家禽咽喉和泄殖腔拭子進(jìn)行檢測(cè)分型的結(jié)果表明，家禽IAV的陽(yáng)性率為9.2％(169/1，839)，其中雞的IAV陽(yáng)性率最高(10

10、.4％;158/1，521);咽喉拭子的IAV陽(yáng)性率(7.5％;138/1，839)顯著高于泄殖腔拭子的IAV陽(yáng)性率(5.2％;95/1，839;P＜10-4)，同時(shí)咽喉拭子含有的IAV拷貝數(shù)也明顯高于泄殖腔拭子(106.07 Vs.10554;P＜10.4);在IAV陽(yáng)性家禽樣品中，H9N2和H7N9血清亞型分別占56.8％(96/169)和41.4％(70/169)。本研究建立的一步反轉(zhuǎn)錄FRET-qPCR方法靈敏度高，能快速方便地