A型流感病毒冷適應(yīng)減毒株拯救體系的建立.pdf

1、“∞^，』ⅡLUL——一女自』近塹——一◇j西蛙農(nóng)林針提大學(xué)2007屆攻讀碩士學(xué)位研究生學(xué)位(畢業(yè))論文A型流感病毒冷適應(yīng)減毒株拯救體系的建立學(xué)科專業(yè)研究方向研究生指導(dǎo)教師完成時(shí)間亟墮量匿呈——_重嫂理勒韭到赴——鰻地——皿縫型皿窶璺王疊睦硒盥雖——!QQ!至旦COS一1細(xì)胞，33℃、5116cQ培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)染上清液接種10日齡SPF雞胚，96h后檢測(cè)雞胚尿囊液血凝效價(jià)，得到有血凝性的重組A型流感病毒rMDVA，電鏡形態(tài)觀察rl“DV

2、A，與野生型流感病毒相似。rMDV—A在雞胚中傳至4代后，收集尿囊液，RTPCR擴(kuò)增6個(gè)內(nèi)部基因片段，測(cè)序，序列分析與鼢VA6個(gè)內(nèi)部基因片段序列一致，說明rMI)VA能在雞胚中穩(wěn)定增殖。rMDVA在不加胰酶的情況下感染MDCK細(xì)胞，能引起細(xì)胞變圓、脫落等病變。收集PR8和rMDVA病毒在33℃、37℃、3812和3912四個(gè)溫度培養(yǎng)的雞胚尿囊液，測(cè)定兩種病毒在^DCK細(xì)胞上空斑形成單位(PFU)，結(jié)果表明rMDVA效價(jià)隨著溫度的升高有明

3、顯下降趨勢(shì)。到39℃時(shí)，病毒效價(jià)急劇下降，可見rMDVA對(duì)溫度敏感，較低溫度(如33℃)更適于rMDVA病毒的繁殖。rMDVA的拯救和鑒定，說明成功建立了A型流感病毒冷適應(yīng)減毒株拯救體系，為開發(fā)A型流感病毒減毒疫苗奠定了基礎(chǔ)306～07A型流感病毒冷適應(yīng)候選疫苗株的拯救RT—PcR擴(kuò)增06～07A型流感病毒推薦疫苗組分株A／NewCaledonia／20／99(HINI)和A／wisconsin／67／2005(H3N2)的HA和NA基

4、因，連接pGEM—T載體并測(cè)序，得到序列正確的HA和NA基因。并克隆至雙向轉(zhuǎn)錄／表達(dá)載體pAD3000上，分別與肋V’A6個(gè)內(nèi)部基因共轉(zhuǎn)染COS一1細(xì)胞，33℃、5％C0：培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)染上清液接種10日齡SPF雞胚，96h后撿測(cè)雞胚尿囊液血凝效價(jià)，得到有血凝性的重組A型流感病毒r如V吐一Hl，rMDVAH3，拯救出06～07A型流感病毒冷適應(yīng)候選疫苗株，為06～07流感病毒減毒三價(jià)疫苗的開發(fā)與生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本研究運(yùn)用8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)建立