電化學(xué)免疫傳感器快速檢測甲型流感病毒的研究.pdf

1、流感病毒長期威脅人類健康，其中甲型流感病毒每年都會出現(xiàn)并不斷變異，有時甚至?xí)?dǎo)致流感疫情大規(guī)模爆發(fā)流行，而防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一便是通過檢測病原體對流感疑似病例的快速篩查和診斷?，F(xiàn)有的病毒分離培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法以及熒光定量PCR等檢測方法在疫情檢測中發(fā)揮了重要作用，但在時效性、靈敏度和操作簡便性方面仍存在不足，不能滿足病原體現(xiàn)場快速檢測的需求。
　　針對上述需求，本論文以A/Beijing/501/2009甲型H1N1

2、流感病毒為檢測對象，于一次性絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)上構(gòu)建了甲型H1N1流感病毒電化學(xué)免疫生物傳感器(EIS)，探索了流感病毒的電化學(xué)免疫傳感分析檢測的相關(guān)機(jī)制，建立了甲型H1N1流感病毒電化學(xué)免疫生物傳感檢測技術(shù)和方法，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)對實驗研究所需的材料，如流感病毒和相應(yīng)的單克隆抗體和HRP標(biāo)記抗體進(jìn)行了培養(yǎng)和收集，并對這些材料進(jìn)行了驗證。用WHO推薦引物經(jīng)RT-PCR驗證以及流感病毒AB分型檢測膠體金試紙條檢

3、測，結(jié)果表明培養(yǎng)的A/Beijing/501/2009(H1N1)雞胚尿囊液確屬甲型H1N1型流感病毒，血凝實驗測定其病毒滴度為128HA Unit，證明所培養(yǎng)的A/Beijing/501/2009(H1N1)雞胚尿囊液可以用于后續(xù)的實驗研究。同時還通過ELISA實驗考察了所收集到的單克隆抗體A1-24和HRP標(biāo)記單抗A1-6-HRP分別與甲型H1N1型流感病毒的親和力，結(jié)果表明這兩種抗體材料能與甲型H1N1流感病毒形成親和力較高的免疫

4、夾心復(fù)合物，該模式可以用于構(gòu)建甲型H1N1流感病毒電化學(xué)免疫傳感器。
　　(2)考察比較了由不同修飾材料和方法修飾電極的電化學(xué)特點，發(fā)現(xiàn)捕獲抗體經(jīng)物理吸附法固定修飾電極后具有較高的信號/本底值比、操作步驟簡單且不需要使用價格昂貴的納米材料或其他化學(xué)修飾材料，成本低廉，故最終選擇此方法作為捕獲抗體修飾固定電極的方法，并以此構(gòu)建甲型H1N1流感病毒電化學(xué)免疫傳感器。通過循環(huán)伏安法對該型免疫傳感器的電化學(xué)行為進(jìn)行了表征，結(jié)果表明該傳感器

5、表面的電活性物質(zhì)主要通過擴(kuò)散傳質(zhì)方式產(chǎn)生電信號，在傳感器上產(chǎn)生的電流響應(yīng)信號與電極上加入的被測抗原的濃度呈正比關(guān)系，適用于對被測抗原進(jìn)行定量測定。
　　(3)優(yōu)化了影響傳感器檢測性能的主要工作條件:檢測中捕獲抗體H1-24和檢測抗體A1-6-HRP的濃度分別采用400μg/ml和80μg/ml，在此濃度條件下檢測信號都比較強(qiáng)，均能達(dá)到最大信號值的80％以上，能夠?qū)崿F(xiàn)對A(H1N1)流感病毒的靈敏檢測。孵育最佳溫度均為37℃，在此溫

6、度下抗原抗體反應(yīng)的活性最高，反應(yīng)能快速達(dá)到平衡狀態(tài)，有利于提高反應(yīng)效率?？乖皺z測抗體的最佳孵育時間分別為45min和30min，在以上孵育時間條件下，檢測的靈敏度均較高，經(jīng)過優(yōu)化后該免疫傳感器的檢出時間縮短至2h以內(nèi)，比傳統(tǒng)的ELISA法整體測定時間減少了1～2h，利用這種新型傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對A(H1N1)流感病毒的快速檢測。
　　(4)建立了電化學(xué)免疫傳感器測定甲型H1N1流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及測定甲型H1N1流感病毒相應(yīng)的

7、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)標(biāo)準(zhǔn)曲線和熒光定量法(qPCR)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于對傳感器各項檢測性能指標(biāo)進(jìn)行考察。針對A(H1N1)流感病毒的檢測信號與針對甲型H7N9、H3N2、B型流感病毒、EV71以及腺病毒等陰性對照的信號的統(tǒng)計分析檢驗結(jié)果表明，該傳感器的特異性良好。重復(fù)性測定結(jié)果顯示該傳感器的RSD＜10％，回收率為80％～110％，呈現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確度和精密度。穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示該傳感器儲存10天內(nèi)檢測信號幾乎不下降，30天后的測定值

8、也能保持在85％以上，具有較好的存儲穩(wěn)定性。EIS法的檢測下限可達(dá)0.41 HA Unit，與ELISA法相當(dāng)，并能對4～64HA Unit范圍內(nèi)的甲型H1N1流感病毒實現(xiàn)定量測定，且EIS的總體假陽性率為10.0％，優(yōu)于ELISA法。所建立的EIS法與qPCR的測定結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.9517，說明EIS法定量的準(zhǔn)確度能達(dá)到與qPCR一致的水平。
　　(5)最后應(yīng)用微型化的Emstat電化學(xué)檢測設(shè)備，基于便攜的陣列化電極以甲型H