生理節(jié)律與一種新型功能型葡聚糖對哺乳動物肝損傷保護作用的研究.pdf

1、肝臟損傷由于其誘因的普遍性和多樣性而在人群中廣泛存在。臨床上的數(shù)據(jù)揭示了肝損傷的眾多病理學(xué)特征,其中與生理節(jié)律的聯(lián)系正逐漸被人們重視。生理節(jié)律是生物體內(nèi)各種生理活動呈現(xiàn)節(jié)律性擺動的現(xiàn)象,大量報道證明了生理節(jié)律的紊亂聯(lián)系著很多疾病的發(fā)生,肝病也不例外,但到目前為止,肝損傷與生物鐘的聯(lián)系僅限于臨床上的表型數(shù)據(jù),其深層的分子聯(lián)系即肝損傷的發(fā)生如何影響分子生物鐘系統(tǒng)及生物鐘系統(tǒng)又是如何影響肝損傷的發(fā)生還未有報道。 本研究基于這一現(xiàn)狀利用生物鐘基

2、因敲除小鼠為工具,較為系統(tǒng)的研究了生物鐘基因?qū)Ω闻K損傷發(fā)生的影響及其機制。另一方面,雖然近些年來對肝損傷發(fā)生機制的研究取得了顯著的成果,但目前用于臨床上的廉價安全的藥物還十分稀少。本研究的另一主要內(nèi)容即是系統(tǒng)的評估一種新型β-葡聚糖——索拉膠對肝臟急性損傷可能的保護作用及相關(guān)機制,以為其成為潛在的肝損傷治療藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　 本研究首先確定肝臟典型慢性損傷——肝纖維化的發(fā)生對肝內(nèi)各主要生物鐘基因節(jié)律性表達的影響以確定肝損傷

3、與生物鐘系統(tǒng)的分子聯(lián)系。熒光定量PCR結(jié)果顯示相比于正常小鼠,纖維化小鼠肝內(nèi)Clock和Per1的平均表達量有所提高;Bmall和Perl的表達變化強度被削弱了;Clock,Per1和Cry1的峰值表達時間有所延遲;Cry2的表達則失去了節(jié)律。此外,兩個重要的生物鐘調(diào)控基因PPARα和POR的平均表達量和表達振幅在纖維化小鼠肝內(nèi)明顯下調(diào)。只有Per2的表達未因肝纖維化的發(fā)生而產(chǎn)生明顯變化,預(yù)示著Per2對肝損傷的發(fā)生可能起著重大的作用。

4、為了驗證這一推斷,本研究進一步的在Per2敲除(Per2-/-)小鼠與野生(WT)小鼠體內(nèi)建立不同肝損傷模型以研究Per2對肝損傷的影響及其機制。CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷實驗表明,CCl4注射24h后,Per2-/-小鼠血清肝損傷標(biāo)志酶ALT及AST的活性和肝組織壞死面積均明顯高于WT小鼠,進一步的,HPLC結(jié)果顯示Per2-/-小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ATP的含量顯著低于WT小鼠,抑制ATP合成的基因Ucp-2在Per2-/-小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的表達比

5、WT小鼠更加強烈。這些數(shù)據(jù)表明Per2可以通過抑制Ucp-2的表達以穩(wěn)定胞內(nèi)ATP的水平從而緩解由CCl4誘導(dǎo)的肝臟急性損傷。在Per2-/-及WT小鼠體內(nèi)注射CCl44周建立肝纖維化模型,肝臟馬松染色及肝星狀細(xì)胞(HSC)激活標(biāo)志蛋白α-SMA的免疫組化結(jié)果顯示Per2-/-小鼠纖維化肝內(nèi)膠原的相對含量和α-SMA蛋白表達量均明顯高于WT小鼠。進一步的,纖維化Per2-/-小鼠血清的ALT和AST活性明顯高于纖維化WT小鼠。另一方面,

6、相比于WT小鼠,纖維的恢復(fù)在Per2-/-小鼠體內(nèi)被顯著的削弱了,TUNEL和α-SMA雙染結(jié)果顯示Per2-/-小鼠肝內(nèi)凋亡的星狀細(xì)胞數(shù)目明顯少于WT小鼠,攜帶有Per2 cDNA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染明顯加速了HSC-T6細(xì)胞的凋亡,這些實驗證明了Per2基因一方面可以緩解肝臟急性損傷以抑制纖維化的發(fā)生,更重要的是Per2可以加速肝星狀細(xì)胞的凋亡從而加快纖維的降解以削弱纖維化的發(fā)展。膽總管結(jié)扎(BDL)致阻塞性膽汁淤積肝損傷模型也證明了Per2

7、基因?qū)Ω闻K的保護作用,BDL10天后,Per2-/-小鼠肝臟的壞死面積及膠原堆積均比WT小鼠嚴(yán)重。膽汁淤積性肝損傷促進基因PAI在Per2-/-小鼠肝臟內(nèi)明顯上調(diào)表達。以上實驗揭示了生物鐘基因Per2對肝損傷發(fā)生的保護作用,初步的提供了肝損傷與生物鐘系統(tǒng)的分子聯(lián)系。
　　 索拉膠是本實驗室近期分離純化的一種由新型土壤桿菌Agrobacterium sp.ZX09生產(chǎn)的胞外可溶性β-葡聚糖。給預(yù)處理PBS或索拉膠4天的小鼠大量灌食

8、酒精建立急性酒精性肝損傷模型,結(jié)果顯示,預(yù)處理索拉膠小鼠血清ALT,AST的活性及總膽固醇(TC),總甘油三酯(TG)和肝組織TC,TG的含量均明顯低于PBS組小鼠。肝臟病理切片數(shù)據(jù)顯示,發(fā)生在PBS組小鼠肝內(nèi)的脂質(zhì)堆積在索拉膠組小鼠肝內(nèi)被明顯削弱了。進一步的,索拉膠預(yù)處理顯著的改善了由酒精引起的胞內(nèi)氧化壓力的增加;分解脂質(zhì)的基因PPARα的表達在索拉膠預(yù)處理組內(nèi)被明顯上調(diào),脂質(zhì)合成基因DGAT1的表達則被明顯下調(diào)。這些數(shù)據(jù)明確的說明了

9、索拉膠可以很好的緩解由酒精引起的急性肝損傷。CCl4急性肝損傷實驗顯示,索拉膠預(yù)處理3天的小鼠在CCl4注射24h和48h后血清的ALT,AST和LDH活性明顯低于PBS組小鼠,肝臟病理切片數(shù)據(jù)顯示,索拉膠預(yù)處理組小鼠初期的肝細(xì)胞變性及壞死較PBS組得到了明顯的改善,且后期的肝組織恢復(fù)被明顯加快了。索拉膠可以大面積上調(diào)胞內(nèi)多種抗氧化基因的表達且PCNA免疫組化數(shù)據(jù)顯示增殖的肝細(xì)胞在索拉膠預(yù)處理小鼠肝內(nèi)明顯增多了。這些數(shù)據(jù)證明了索拉膠可以