碳納米管-SYBR GreenⅠ熒光探針在沙門氏菌檢測中的應用.pdf

1、納米晶體、納米管等無機材料具有特殊的結構特征，在一些小分子(核酸或蛋白質)的檢測中顯示出很好的性能。單壁碳納米管(SWNTs)能夠與寡核苷酸的堿基通過π-π非共價鍵作用形成穩(wěn)定的狀態(tài)。同時SWNTs具有抗光漂白作用以及近紅外波長的熒光特性?？稍谏茖W研究中作為熒光探針的載體。本文以SWNTs為載體，借助熒光染料SYBR Green I(SG)特殊的熒光性質，對沙門氏菌屬的兩種血清型鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌進行快速檢測，主要展開以下

2、兩個方面的工作：
　　 1.檢測含trps基因的鼠傷寒沙門氏菌。本研究方法利用熒光的淬滅和恢復對含trps基因的鼠傷寒沙門氏菌進行檢測，SWNTs對寡核苷酸(ssDNA)特異的結合作用和SG對核酸分子(包括ssDNA和dsDNA)特異的插入作用及極強靈敏性，建立一種快速檢測含trpS基因的鼠傷寒沙門氏菌的方法。在本檢測體系中，單獨存在的SG分子是幾乎不能產生熒光信號的。當加入探針分子(ssDNA)后，由于SG和探針DNA的插入作

3、用能夠檢測到SG的熒光信號(520nm)。隨后，SWNTs的加入，由于SWNTs選擇性的與探針DNA的非共價作用使得探針DNA分子與SG分離，SG游離而不發(fā)熒光，SWNTs間接的淬滅了SG的熒光。當加入靶序列后，靶序列通過與探針DNA分子的雜交作用迅速的形成雙鏈的DNA分子(dsDNA)而脫離SWNTs的吸附作用，SG插入到雙鏈DNA分子中，熒光信號得到恢復。而加入誤配堿基序列和其它菌的DNA時，SG的熒光強度不會恢復。實驗結果表明，通

4、過檢測SG熒光的變化可對攜帶trps基因的鼠傷寒沙門氏菌進行檢測，而且此方法具有高的靈敏性和特異性。通過該方法，濃度為1.8nM的目標DNA可以得到檢測。用該方法，在僅僅只加入終濃度為1.8nM目標DNA的情況下，熒光值的恢復率達到了78％。熒光值的增強值達到4.54。特異性檢測的結果也證明該檢測方法可以區(qū)分具有高同源性的核酸序列(1-或3-nt的區(qū)別)。此外，這種方法用于含有trps基因的鼠傷寒沙門氏菌的實際樣本也有很好的效果，在用菌

5、中提取的DNA的PCR擴增產物時，熒光信號的恢復效果非常好，熒光值的增強值達到了3.15。
　　 2.檢測腸炎沙門氏菌的16SrRNA。本研究方法利用熒光的淬滅和恢復對腸炎沙門氏菌的16SrRNA進行檢測，SWNTs對寡核苷酸(ssDNA)共價的聯(lián)接作用以及特異的非共價結合作用和SG對核酸分子(包括ssDNA和dsDNA)特異的插入作用及極強靈敏性，建立一種快速檢測腸炎寒沙門氏菌16SrRNA的方法。在本檢測體系中，單獨存在的S

6、G分子是幾乎不能產生熒光信號的。采用一段特異識別腸炎沙門氏菌的DNA探針來特異識別腸炎沙門氏菌的基因組DNA，而通過識別熒光染料SYBRGreenI(SG)的信號來實現(xiàn)檢測。該段DNA探針首先將通過連接反應共價的修飾到碳納米管上并將通過吸附作用纏繞在碳納米管管壁上，而當體系里加入腸炎沙門氏菌的基因組DNA時，該段核酸序列的游離端將從碳納米管上解纏繞下來，隨后與目標DNA發(fā)生雜交反應形成雙鏈結構并與熒光染料SG結合產生信號。實驗結果表明，

7、通過檢測SG熒光的變化可對腸炎沙門氏菌進行檢測，而且此方法具有高的靈敏性和特異性。通過該方法，濃度為1.8nM的目標DNA可以得到檢測。對于腸炎沙門氏菌16SrRNA的檢測，用該方法，在僅僅只加入終濃度為1.8nM目標DNA的情況下，熒光值的恢復率達到了84%。熒光值的增強值達到13.16。此外，這種方法用于腸炎沙門氏菌16SrRNA基因組的實際樣本檢測也有很好的效果，在用菌中提取的DNA的PCR擴增產物時，熒光信號的恢復效果非常好，熒