雙鏈DNA對HBV復制的影響及其胞內信號傳導.pdf

1、目的：
　　 1. 觀察雙鏈DNA分子 poly(dA-dT)?poly(dT-dA)是否能夠誘導肝細胞產生Ⅰ型干擾素及其可能的分子通路。
　　 2. 了解HBV感染是否影響細胞對dsDNA刺激產生的反應，觀察poly(dA-dT)?poly(dT-dA)對肝細胞內HBV復制的影響及其信號傳導。
　　 3. 探討胞內DNA受體DAI(DLM-1/ZBP1)分子在poly(dA-dT)?poly(dT-dA)誘導的

2、Ⅰ型干擾素的產生與HBV復制中的可能作用。
　　 方法：
　　 1. Poly(dA-dT)?poly(dT-dA)轉染HepG2與HepG2215細胞，real time RT-PCR檢測Ⅰ型干擾素IFN-β、干擾素應答基因IFIT1與炎癥因子TNF-α的表達，western blot檢測NF-κB、IRF3、TBK1以及磷酸化的TBK1的表達。
　　 2. HBV1.3復制型質粒pHY106+wta轉染Hep

3、G2細胞，HBV siRNA轉染HepG2215，real time RT-PCR檢測細胞中IFIT1的表達。
　　 3. Poly(dA-dT)·poly(dT-dA)轉染HepG2215細胞，southern blot檢測細胞內HBV的復制中間體，real time PCR檢測細胞上清中HBV顆粒，CMIA檢測HBV s抗原與e抗原的表達。利用抑制劑阻斷NF-κB、IRF3以及MAPK激酶信號通路，southern blot

4、觀察poly(dA-dT)·poly(dT-dA)對肝細胞內HBV復制中間體的影響。Western blot檢測細胞內ERK1/2的磷酸化。
　　 4. RT-PCR、western blot檢測DAI(DLM-1/ZBP1)分子在肝癌細胞系中的表達。DAI(DLM-1/ZBP1)siRNA轉染HepG2與HepG2215細胞，real time RT-PCR檢測IFIT1的表達，southern blot檢測HepG2215細

5、胞中HBV復制中間體的表達。
　　 結果：
　　 1.Poly(dA-dT)·poly(dT-dA)能夠誘導HepG2215細胞產生Ⅰ型干擾素，且具時間與劑量依賴性，HepG2215細胞與HepG2細胞對poly(dA-dT)·poly(dT-dA)的應答明顯不同，HepG2細胞對poly(dA-dT)·poly(dT-dA)的應答比HepG2215細胞早，但持續(xù)時間短。NF-κB參與了HepG2215細胞中TNF-α的

6、產生，IRF3信號通路參與了poly(dA-dT)?poly(dT-dA)誘導的Ⅰ型干擾素的產生，TBK1在其中發(fā)揮了重要作用。
　　 2.上調或下調肝細胞內HBV的復制與病毒蛋白表達后，再用poly(dA-dT)·poly(dT-dA)處理，肝細胞表達IFIT1的動力學曲線不受影響，但HBV下調后，HepG2215細胞中IFIT1表達明顯升高。
　　 3.Poly(dA-dT)·?poly(dT-dA)能夠促進HepG

7、2215中HBV的復制，但對病毒蛋白的表達及病毒粒子分泌沒有影響。ERK/MAPK信號通路抑制劑U0126能抑制poly(dA-dT)·poly(dT-dA)增強的HBV復制。Poly(dA-dT)?poly(dT-dA)作用HepG2215后，能夠減弱ERK1/2的磷酸化。
　　 4.在HepG2、HepG2215以及Huh7中存在不同程度的DAI(DLM-1/ZBP1)分子的表達，在維甲酸RA以及TLR2配體Pam3cys、

8、TLR4配體LPS的刺激下，DAI(DLM-1/ZBP1)表達增強。DAI(DLM-1/ZBP1)分子表達下調不影響HepG2與HepG2215細胞中IFIT1的表達，但HepG2215細胞中HBV的復制明顯減弱。
　　 結論：
　　 1.Ds-DNA能夠刺激肝癌細胞HepG2與HepG2215產生Ⅰ型干擾素應答，同時伴隨IRF3與NF-κB的活化。
　　 2.Ds-DNA能夠促進HBV的復制，但不影響病毒蛋白表

9、達與病毒粒子分泌，ERK/MAPK信號通路可能參與了這一事件。
　　 3. 在人肝癌細胞中存在DAI(DLM-1/ZBP1)分子的表達，DAI(DLM-1/ZBP1)分子不參與ds-DNA誘導的Ⅰ型干擾素的產生，但可能通過直接或間接的方式影響HBV的復制。
　　 本研究的創(chuàng)新點及意義：
　　 1.了解雙鏈DNA能否誘導肝細胞產生Ⅰ型干擾素應答，探討相關的信號分子通路，同時觀察雙鏈DNA對肝細胞內HBV復制的影響，