雙鏈DNA對(duì)HBV復(fù)制的影響及其胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo).pdf

1、目的：
　　 1. 觀察雙鏈DNA分子 poly(dA-dT)?poly(dT-dA)是否能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素及其可能的分子通路。
　　 2. 了解HBV感染是否影響細(xì)胞對(duì)dsDNA刺激產(chǎn)生的反應(yīng)，觀察poly(dA-dT)?poly(dT-dA)對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響及其信號(hào)傳導(dǎo)。
　　 3. 探討胞內(nèi)DNA受體DAI(DLM-1/ZBP1)分子在poly(dA-dT)?poly(dT-dA)誘導(dǎo)的

2、Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生與HBV復(fù)制中的可能作用。
　　 方法：
　　 1. Poly(dA-dT)?poly(dT-dA)轉(zhuǎn)染HepG2與HepG2215細(xì)胞，real time RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型干擾素IFN-β、干擾素應(yīng)答基因IFIT1與炎癥因子TNF-α的表達(dá)，western blot檢測(cè)NF-κB、IRF3、TBK1以及磷酸化的TBK1的表達(dá)。
　　 2. HBV1.3復(fù)制型質(zhì)粒pHY106+wta轉(zhuǎn)染Hep

3、G2細(xì)胞，HBV siRNA轉(zhuǎn)染HepG2215，real time RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中IFIT1的表達(dá)。
　　 3. Poly(dA-dT)·poly(dT-dA)轉(zhuǎn)染HepG2215細(xì)胞，southern blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制中間體，real time PCR檢測(cè)細(xì)胞上清中HBV顆粒，CMIA檢測(cè)HBV s抗原與e抗原的表達(dá)。利用抑制劑阻斷NF-κB、IRF3以及MAPK激酶信號(hào)通路，southern blot

4、觀察poly(dA-dT)·poly(dT-dA)對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體的影響。Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化。
　　 4. RT-PCR、western blot檢測(cè)DAI(DLM-1/ZBP1)分子在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)。DAI(DLM-1/ZBP1)siRNA轉(zhuǎn)染HepG2與HepG2215細(xì)胞，real time RT-PCR檢測(cè)IFIT1的表達(dá)，southern blot檢測(cè)HepG2215細(xì)

5、胞中HBV復(fù)制中間體的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.Poly(dA-dT)·poly(dT-dA)能夠誘導(dǎo)HepG2215細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素，且具時(shí)間與劑量依賴性，HepG2215細(xì)胞與HepG2細(xì)胞對(duì)poly(dA-dT)·poly(dT-dA)的應(yīng)答明顯不同，HepG2細(xì)胞對(duì)poly(dA-dT)·poly(dT-dA)的應(yīng)答比HepG2215細(xì)胞早，但持續(xù)時(shí)間短。NF-κB參與了HepG2215細(xì)胞中TNF-α的

6、產(chǎn)生，IRF3信號(hào)通路參與了poly(dA-dT)?poly(dT-dA)誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，TBK1在其中發(fā)揮了重要作用。
　　 2.上調(diào)或下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)HBV的復(fù)制與病毒蛋白表達(dá)后，再用poly(dA-dT)·poly(dT-dA)處理，肝細(xì)胞表達(dá)IFIT1的動(dòng)力學(xué)曲線不受影響，但HBV下調(diào)后，HepG2215細(xì)胞中IFIT1表達(dá)明顯升高。
　　 3.Poly(dA-dT)·?poly(dT-dA)能夠促進(jìn)HepG

7、2215中HBV的復(fù)制，但對(duì)病毒蛋白的表達(dá)及病毒粒子分泌沒(méi)有影響。ERK/MAPK信號(hào)通路抑制劑U0126能抑制poly(dA-dT)·poly(dT-dA)增強(qiáng)的HBV復(fù)制。Poly(dA-dT)?poly(dT-dA)作用HepG2215后，能夠減弱ERK1/2的磷酸化。
　　 4.在HepG2、HepG2215以及Huh7中存在不同程度的DAI(DLM-1/ZBP1)分子的表達(dá)，在維甲酸RA以及TLR2配體Pam3cys、

8、TLR4配體LPS的刺激下，DAI(DLM-1/ZBP1)表達(dá)增強(qiáng)。DAI(DLM-1/ZBP1)分子表達(dá)下調(diào)不影響HepG2與HepG2215細(xì)胞中IFIT1的表達(dá)，但HepG2215細(xì)胞中HBV的復(fù)制明顯減弱。
　　 結(jié)論：
　　 1.Ds-DNA能夠刺激肝癌細(xì)胞HepG2與HepG2215產(chǎn)生Ⅰ型干擾素應(yīng)答，同時(shí)伴隨IRF3與NF-κB的活化。
　　 2.Ds-DNA能夠促進(jìn)HBV的復(fù)制，但不影響病毒蛋白表

9、達(dá)與病毒粒子分泌，ERK/MAPK信號(hào)通路可能參與了這一事件。
　　 3. 在人肝癌細(xì)胞中存在DAI(DLM-1/ZBP1)分子的表達(dá)，DAI(DLM-1/ZBP1)分子不參與ds-DNA誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，但可能通過(guò)直接或間接的方式影響HBV的復(fù)制。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及意義：
　　 1.了解雙鏈DNA能否誘導(dǎo)肝細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素應(yīng)答，探討相關(guān)的信號(hào)分子通路，同時(shí)觀察雙鏈DNA對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響，