miR-193a影響B(tài)VDV在牛胞內(nèi)復(fù)制的分子機(jī)制研究.pdf

1、關(guān)于BVDV引起的持續(xù)性感染發(fā)生的分子機(jī)制尚未研究清楚，最關(guān)鍵的是BVDV與宿主細(xì)胞之間相互作用關(guān)系尚未系統(tǒng)性闡述。大量研究表明，當(dāng)病毒入侵機(jī)體細(xì)胞，機(jī)體細(xì)胞會(huì)主動(dòng)誘發(fā)凋亡，或凋亡被誘導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致被感染細(xì)胞的死亡以及病毒的清除。本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)中使用solexa高通量測(cè)序檢測(cè)了BVDV感染靶細(xì)胞MDBK后的差異表達(dá)譜顯示：miR-193a的表達(dá)量顯著性升高，且通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析miR-193a靶向凋亡通路中的相關(guān)基因Bax。所以本

2、研究以miR-193a為研究對(duì)象，探究miR-193a作用于靶蛋白，影響凋亡和BVDV復(fù)制的分子機(jī)制，進(jìn)而為闡述BVDV的持續(xù)性感染和BVDV防控新方法奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：探究miR-193a靶向凋亡通路靶蛋白，進(jìn)而影響凋亡和BVDV復(fù)制的分子機(jī)制。
　　方法：⑴依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期高通量測(cè)序結(jié)果，選擇了顯著性上調(diào)表達(dá)的miR-193a進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；⑵擴(kuò)增miR-193a前體及其抑制劑pre-miR-193a-IN，并克隆

3、至慢病毒pll3.7載體中；包裝慢病毒，感染MDBK細(xì)胞；利用 qRT-PCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)和抑制 miR-193a的作用效果；⑶轉(zhuǎn)染 miR-193a的模擬物和抑制劑進(jìn)入MDBK細(xì)胞，qRT-PCR檢測(cè)BVDV的復(fù)制水平；⑷使用生物信息軟件預(yù)測(cè)miR-193a的靶基因，構(gòu)建pmirGLO-Bax3’UTR重組熒光載體，與pll3.7-miR-193載體共轉(zhuǎn)染至 MDBK細(xì)胞，使用熒光分光光度計(jì)驗(yàn)證 miR-193a直接靶向靶基因；⑸過(guò)表達(dá)

4、和抑制miR-193a后qRT-PCR檢測(cè)Bax的轉(zhuǎn)錄水平，Western blot檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)量并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率；⑹利用Methprimer軟件于 pre-miR-193a上游設(shè)計(jì)啟動(dòng)子引物，擴(kuò)增并克隆至熒光素酶載體pGL3-Basic中，使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)可能的啟動(dòng)子；⑺根據(jù)可能的啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)甲基化檢測(cè)引物，使用亞硫酸鹽修飾處理的 BVDV感染和未感染的MDBK細(xì)胞全基因組DNA為模板擴(kuò)增并克隆至T載體中，甲基

5、化測(cè)序后分析結(jié)果；⑻設(shè)計(jì)干擾甲基化位點(diǎn)的shRNA，構(gòu)建shRNA-慢病毒重組載體，包裝慢病毒并侵染MDBK后提取全基因組，經(jīng)亞硫酸鹽處理后為模板擴(kuò)增并克隆至T載體，甲基化測(cè)序后分析甲基化程度；⑼檢測(cè)不同的shRNA-慢病毒處理后，miR-193a的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：①過(guò)表達(dá)pre-miR-193a慢病毒處理后能顯著性上調(diào)miR-193a的表達(dá)；相反，過(guò)表達(dá) pre-miR-193a-IN慢病毒處理后能顯著性下調(diào) miR-19

6、3a的表達(dá)；②qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-193a模擬物后的BVDV復(fù)制水平顯著性降低，即過(guò)表達(dá)miR-193a能抑制BVDV的復(fù)制；③雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-193a能直接靶向于 Bax蛋白，并抑制 Bax的表達(dá)；④流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pll3.7-pre-miR-193a的MDBK細(xì)胞凋亡率顯著性上升；Western blotting檢測(cè)顯示Bax表達(dá)下調(diào)，即miR-193a能靶向凋亡相關(guān)基因Bax，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡；⑤

7、成功構(gòu)建了pGL3-Basic-gene熒光素酶重組載體，并利用熒光分光光度計(jì)驗(yàn)證可能的啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)閙iR-193a-P4；⑥利用軟件成功分析了甲基化的程度顯示：BVDV感染的MDBK細(xì)胞內(nèi)miR-193a啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度比未感染BVDV的MDBK細(xì)胞下調(diào)19％，證明BVDV感染導(dǎo)致miR-193a啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生去甲基化；⑦甲基化測(cè)序檢測(cè)shRNA-慢病毒感染的MDBK細(xì)胞中miR-193a啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度的結(jié)果顯示：pll3

8、.7-193a-promoter shRNA-2慢病毒處理后顯著性降低甲基化程度，而且增加了miR-193a的表達(dá)，此段區(qū)域最可能為miR-193a的啟動(dòng)子；⑧熒光定量PCR結(jié)果顯示pll3.7-193a-promoter shRNA-2慢病毒處理后miR-193a表達(dá)水平最高。
　　結(jié)論：⑴miR-193a可作用于促凋亡基因Bax誘發(fā)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞在凋亡發(fā)生時(shí)形成凋亡小體，吞噬細(xì)胞將凋亡小體吞噬，進(jìn)而發(fā)揮溶酶體的融合和降解作用，

9、最終將BVDV病毒降解并清除，miR-193a就抑制了BVDV的復(fù)制。⑵預(yù)測(cè)并初步鑒定了miR-193a的可能的啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)閙iR-193a-P4；在BVDV感染后可能導(dǎo)致了 miR-193a啟動(dòng)子區(qū)域的去甲基化，從而調(diào)控 miR-193a的表達(dá)上調(diào)；pll3.7-193a-promoter shRNA-2慢病毒能顯著性降低甲基化程度，進(jìn)而增加miR-193a的表達(dá)，更精確了miR-193a的可能的啟動(dòng)子區(qū)域，為有效調(diào)控miR-193a