胞質(zhì)內(nèi)DNA識別蛋白在HBV復(fù)制中的作用.pdf

1、目的
　　1、觀察乙型肝炎病毒(HBV)對肝癌細(xì)胞系HepG2產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答的影響。
　　2、了解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DNA識別受體(AIM2、HMGB1、DAI)對肝癌細(xì)胞系HepG2中HBV復(fù)制的影響及其可能機(jī)制。
　　方法
　　1、用HBV1.3復(fù)制型質(zhì)粒pHY106+wta轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2,分別在既定時間點(diǎn)提取細(xì)胞總RNA,RealtimeRT-PCR檢測天然免疫信號分子表達(dá)情況。
　　2、用不同濃

2、度AIM2siRNA、HMGB1siRNA、DAIsiRNA與HBV1.3復(fù)制型質(zhì)粒pHY106+wta共同轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系HepG2,southernblot檢測細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體;realtimeRT-PCR檢測DAI、HMGB1、AIM2表達(dá)情況;ELISA檢測細(xì)胞上清中HBsAg與HBeAg的表達(dá)情況;并分析對HBV復(fù)制所誘導(dǎo)的天然免疫產(chǎn)生的IFIT1、IL-6、MxA表達(dá)的影響。
　　3、聯(lián)合阻斷兩個DNAsensor

3、s對HBV復(fù)制及蛋白表達(dá)的影響。southernblot檢測細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制中間體,ELISA檢測細(xì)胞上清中HBsAg與HBeAg的表達(dá)情況。
　　4、MTT法檢測siRNA與HBV1.3復(fù)制型質(zhì)粒pHY106+wta共轉(zhuǎn)后對細(xì)胞生長的影響。
　　結(jié)果
　　1、HBV1.3復(fù)制型質(zhì)粒pHY106+wta轉(zhuǎn)染HepG2后可以啟動短暫的天然免疫應(yīng)答,可以激活DAI、AIM2一過性升高。
　　2、下調(diào)DAI、HMGB1

4、的表達(dá)后HBV的復(fù)制均受到抑制,同時HBsAg和HBeAg的分泌也受到明顯抑制。而AIM2表達(dá)下調(diào)后HBV復(fù)制明顯增強(qiáng),同時HBsAg和HBeAg的分泌也增多。
　　3、隨著siRNA濃度的升高,AIM2對HBV蛋白分泌的促進(jìn)作用逐漸降低。而HMGB1、DAI識別蛋白則隨著siRNA濃度的升高,對HBsAg和HBeAg抑制效果越明顯。
　　4、DAI與TBK1同時下調(diào)后,HBV蛋白表達(dá)受到抑制,表明DAI的抑制作用起主要作用

5、。DAI與AIM2同時下調(diào)后,也表現(xiàn)出對HBV蛋白表達(dá)的抑制。HMGB1與TBK1同時下調(diào)或HMGB1與AIM2同時下調(diào),都表現(xiàn)出對HBV蛋白表達(dá)的抑制作用。
　　5、不論下調(diào)AIM2、DAI后,對HBV誘導(dǎo)的IFIT1、IL-6、MxA表達(dá)沒有影響。但是下調(diào)HMGB1后,對HBV誘導(dǎo)的IL-6有影響,對IFIT1沒有顯著影響,表明HMGB1參與了HBV誘導(dǎo)的NF-kB-IL-6信號途徑,沒有參與I型IFN信號途徑。
　　6

6、、AIM2、DAI對HepG2細(xì)胞活力沒有明顯影響,而HMGB1影響HepG2活力,對細(xì)胞生長有影響。
　　結(jié)論
　　1、HBV能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答。
　　2、DAI和HMGB1可能通過某未知的信號通路參與了HBV復(fù)制和蛋白表達(dá)過程的調(diào)控,與I型干擾素通路無關(guān)。
　　3、AIM2也參與了HBV復(fù)制和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié),其對HBV復(fù)制影響機(jī)制需要進(jìn)一步研究.
　　本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及意義: