羥基酚酮類化合物通過封閉HBV RNaseH抑制HBV DNA復(fù)制.pdf

1、背景：
　　慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是嚴(yán)重威脅人類健康的一種慢性疾病，世界上每年約有超過一百萬患者死于HB V相關(guān)疾病。HB V是一種逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制的嗜肝DNA病毒，一般根據(jù)基因序列不同將其分為8個基因型（A-H）。目前臨床可用的抗HB V感染藥物主要有干擾素α和核苷（酸）類似物兩大類藥物。干擾素臨床有效率低且存在較多的副作用限制了臨床廣泛應(yīng)用；核苷（酸）類似物能夠?qū)崿F(xiàn)血清表面抗原陰轉(zhuǎn)的比例也僅有3-6％，并且停藥后的高復(fù)發(fā)率，

2、不確切的療程以及逐漸增加的耐藥性等都使其仍然不能成為抗HB V的理想藥物。尋找抗HB V新的治療靶點和開發(fā)與現(xiàn)有藥物不同作用機(jī)制的抗 HB V藥物仍然是迫切需要解決的課題。
　　催化HB V逆轉(zhuǎn)錄過程需要病毒編碼的兩個關(guān)鍵活性酶，即DN A多聚酶和核糖核酸酶H（Ribonuclease H，RNaseH），抑制任何一個都可以抑制HBV DNA的復(fù)制。以DNA多聚酶為靶點的核苷類藥物能夠抑制HBV DNA到臨床檢測下限以下，然而少量

3、殘存的持續(xù)低水平病毒復(fù)制仍然使得難以徹底清除病毒。如果在抑制 DNA多聚酶的同時能抑制 RNaseH的活性，即有可能最大限度抑制HBV DNA的復(fù)制，為耗竭cccDNA提供可能。而通過體外純化獲得有活性HBV RNaseH成為篩選抗HBV RNaseH藥物的關(guān)鍵之一。
　　從眾多的自然和人工化合物中篩選出具有抑制HBV RNaseH活性的化合物是開發(fā)藥物的另一關(guān)鍵。大量研究表明多個托酚酮類化合物對人類免疫缺陷病毒（HIV） RNa

4、seH活性具有較強(qiáng)抑制作用。HBV與HIV同屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，臨床上已經(jīng)證實多個核苷類藥物能夠同時抑制HIV和HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶，而HBV RNaseH和HIV RNaseH同屬于核苷酸轉(zhuǎn)移酶超家族，推測部分托酚酮類化合物可能對HBV RNaseH也存在抑制作用。
　　目的：
　　探索一種能夠純化出有活性HBV RNaseH的方法并建立一種HBV RNaseH抑制劑的生化篩選體系；篩選出能夠通過抑制HBV RNaseH進(jìn)而抑制H

5、BV DNA復(fù)制的化合物；研究HBV不同基因型對RNaseH活性及RNaseH抑制劑敏感性的影響；為開發(fā)新型抗HB V藥物進(jìn)行有益探索。
　　方法：
　　1、構(gòu)建HBV RNaseH和人RNaseH1表達(dá)質(zhì)粒。以C端帶His標(biāo)簽的pTrcHis2B為骨架，分別克隆插入基因合成編碼優(yōu)化的基因 D型和C型 HBV RNaseH序列作為基因 D型（HRHLP-gt.D）和基因 C型（HRHLP-gt.C）HBV RNaseH表達(dá)質(zhì)

6、粒；以質(zhì)粒pMAL-c5xHis為骨架，在MBP下游插入C端帶His標(biāo)簽的基因C型HBV RNaseH序列，構(gòu)成N端帶MBP和C端帶His標(biāo)簽的HBV RNaseH（MBP gt.C）表達(dá)質(zhì)粒。以質(zhì)粒pRsetB為骨架插入基因合成的N端帶His標(biāo)簽的人RNseH1基因序列構(gòu)成人RNaseH1表達(dá)質(zhì)粒。
　　2、RNaseH的表達(dá)和純化。把基因重組合成構(gòu)建的HBV RNaseH和人RNaseH1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LOBSTR E.coli菌株

7、并進(jìn)行蛋白表達(dá)；采用鎳親和層析法進(jìn)行蛋白純化。
　　3、蛋白鑒定。SDS-PAGE膠電泳和Western Blot方法鑒定目的蛋白。
　　4、HBV RNaseH和人RNaseH1酶活性檢測。采用寡核苷酸引導(dǎo)的RNA切割測定法檢測。長264nt的32P標(biāo)記的鴨型HBV RNA（DRF+）與一段長20nt的互補(bǔ) DNA寡核苷酸鏈擬合成部分雙鏈，DRF+雙鏈部分被加入的RNaseH降解后成為長短不同的兩段，可以通過變性膠電泳和放

8、射自顯影方法檢測。
　　5、托酚酮類化合物對HBV RNaseH和人RNaseH1酶活性抑制作用篩選。采用寡核苷酸引導(dǎo)的RN A切割測定法共篩選了51個托酚酮類化合物，不同濃度的待測化合物加入反應(yīng)體系中，具有抑制作用的化合物可以抑制 RNaseH把DRF+切割成兩段。通過變性膠電泳和放射自顯影方法檢測切割產(chǎn)物，I ma geJ軟件定量分析切割產(chǎn)物條帶灰度。
　　6、托酚酮類化合物對HBV DNA的抑制作用。采用HepDES1

9、9細(xì)胞檢測HBV DNA的復(fù)制。細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)48小時后加入待測化合物。每天更換新的含待測化合物的培養(yǎng)基。2天后收獲細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)HBV核心顆粒中的HBV DNA。TaqManPCR分別定量檢測HBV DNA正鏈和負(fù)鏈。
　　7、MTT法細(xì)胞毒性檢測。HepDES19接種于96孔板培養(yǎng)；24小時后加入不同濃度的待測化合物，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，每天更換新的含待測化合物的培養(yǎng)基，2天后加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘后，溶解代謝

10、產(chǎn)物，570 nm波長檢測吸光值。
　　8、檢測不同基因型HBV RNaseH對其抑制劑的敏感性。構(gòu)建基因B型、C型和D型共18個不同序列HBV RNaseH表達(dá)質(zhì)粒，鎳親和層析法純化不同序列HBV RNaseH；寡核苷酸引導(dǎo)的RNA切割法檢測不同HBV RNaseH的活性和同一HBV RNaseH抑制劑（托酚酮化合物#46）對不同HBV RNaseH抑制性的差異。
　　結(jié)果：
　　1、HRHLP-gt.D和HRHLP

11、-gt.C僅有微量表達(dá)，Western blot可以檢測到純化的微量蛋白；MBP gt.C表達(dá)量豐富，SDS-PAGE膠電泳Coomassie染色和Western blot均可檢測到純化的較高純度的目的蛋白。
　　2、HRHLP-gt.D、HRHLP-gt.C和MBP gt.C均顯示出特異性的酶活性。
　　3、純化的HBV RNaseH酶活性在一定溫度和時間內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性。
　　4、所篩選的51個托酚酮類化合物中，

12、共有8個化合物只在60μM時對基因D型和（或）C型HBV RNaseH具有抑制作用；3個化合物在20μM時對基因D型和（或）C型HBV RNaseH具有抑制作用；2個作用最強(qiáng)的化合物（#46和#106）在10μM時對基因D型和C型HBV RNaseH同時具有抑制作用。
　　5、選取在化合物初篩實驗中對基因D型和C型HBV RNaseH均有較強(qiáng)抑制作用的6個托酚酮化合物（#46，#106，#107，#110，#112，#113）進(jìn)行

13、IC50測定。結(jié)果顯示有4個化合物（#46，#106，#107，#110）的IC50值都小于40μM。
　　6、選取共35個托酚酮化合物進(jìn)行對人 RNaseH1的作用初篩，其中包括13個對HBV RNaseH有抑制作用的化合物和12個對HBV RNaseH沒有抑制作用的化合物。有4個化合物在10μM時對HuRH1有抑制作用；14個化合物在60μM或20μM時對HuRH1有抑制作用；17個化合物在60μM時對HuRH1沒有抑制作用。

14、
　　7、托酚酮類化合物在HBV RNaseH和HuRH1之間抑制強(qiáng)弱程度的不同。#46化合物對HuRH1的IC50值約為對HBV RNaseH的10-20倍；#106化合物對HuRH1的IC50值約為對HBV RNaseH的2倍多；#110和#112對HuRH1和HBV RNaseH的IC50值接近；而#113化合物對HuRH1的IC50值約為對HBV RNaseH的1/4。
　　8、檢測的6個托酚酮化合物對HBV DNA

15、抑制作用的EC50均低于10μM，其中最好的#110 EC50只有0.34μM；在每個檢測樣本中的負(fù)鏈DNA合成均沒有抑制或者只有在化合物濃度很高時才被抑制。計算這些化合物的治療指數(shù)最高的#110達(dá)到94。
　　9、選取對HBV DNA正鏈具有選擇性抑制作用的6個羥基酚酮類化合物（#46，#106，#110，#112，#113和#56）進(jìn)行了 HepDES19細(xì)胞毒性檢測。其CC50值介于25μM到79μM之間。
　　10、

16、基因B型、C型和D型及同一基因型不同亞型HBV RNaseH之間活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；但是不同基因型HBV RNaseH對同一HBV RNaseH抑制劑（#46）的敏感性沒有差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、通過 E.coli表達(dá)和鎳親和層析法可以獲得有活性的多種基因型 HBV RNaseH。
　　2、寡核苷酸引導(dǎo)的RNA切割法可以作為一種低通量HBV RNaseH抑制劑體外生化篩選方法。<