磷脂爬行酶1抑制HBV復(fù)制的分子機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是我國(guó)最重大的傳染病之一，HBV感染不僅可以引起急、慢性肝炎，還可導(dǎo)致肝炎、肝硬化和肝癌，在我國(guó)約有1.2億HBV攜帶者，其中2000多萬(wàn)人為慢性乙肝患者。HBV感染和相關(guān)疾病嚴(yán)重影響患者的健康，同時(shí)也給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)在對(duì)HBV感染致病機(jī)理仍不是很清楚，也沒(méi)有對(duì)HBV感染特別有效的藥物。目前臨床上廣泛使用的抗HBV藥物包括干擾素(interferon，I

2、FN)和核苷類似物，但使用干擾素副作用較大，而核苷類似物停藥后容易復(fù)發(fā)，且易發(fā)生耐藥。繼續(xù)研制和開(kāi)發(fā)高效低毒的抗乙型肝炎病毒藥物仍然是當(dāng)務(wù)之急。
　　磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase1，PLSCRl）屬于鈣離子結(jié)合的、棕櫚?；腎I型膜蛋白。研究顯示，非棕櫚?；腜LSCR1也能進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)并與基因組DNA結(jié)合。同時(shí)PLSCR1也是干擾素刺激基因，干擾素可以通過(guò)蛋白激酶C依次激活JNK和STAT1信號(hào)通

3、路，繼而調(diào)控PLSCR1的表達(dá)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)PLSCR1特異性小干擾抑制PLSCRl表達(dá)后，IFN抑制水泡性口炎病毒和腦心肌炎病毒的活性明顯下降，所以上調(diào)PLSCRl表達(dá)有可能通過(guò)增加抗病毒基因的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)IFN的抗病毒活性。我們前期通過(guò)免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PLSCR1與 HBV表面蛋白 PreS1結(jié)構(gòu)域有相互作用，進(jìn)一步研究表明在體內(nèi)外高表達(dá)PLSCR1均可以顯著抑制HBV復(fù)制，但是其作用機(jī)制尚不明確，基于這些研究結(jié)果，本課題繼

4、續(xù)研究PLSCR1與HBV復(fù)制的關(guān)系，為進(jìn)一步研究HBV與宿主相互作用奠定基礎(chǔ)，為臨床HBV治療提供新的思路。
　　目的：探討人磷脂爬行酶1抑制 HBV復(fù)制的分子機(jī)制。
　　方法：將PLSCR1質(zhì)粒與HBV1.3質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，提取細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中HBV-DNA，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)PLSCR1與HBV1.3質(zhì)粒不同比例轉(zhuǎn)染后對(duì)HBV復(fù)制的抑制情況；設(shè)計(jì)合成PLSCR1特異性siRNA，通過(guò)半定量PCR和We

5、stern blot等方法驗(yàn)證siRNA對(duì)PLSCR1在mRNA水平和蛋白水平的抑制作用；將經(jīng)過(guò)干擾素處理的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBV1.3質(zhì)粒和PLSCR1特異性siRNA，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后通過(guò)半定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中PLSCR1 mRNA表達(dá)水平變化，通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中HbsAg、HbeAg表達(dá)量的變化；在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染PLSCR1質(zhì)粒、PLSCR1 siRNA、HBV1.3質(zhì)粒48h后采用CCK-8檢測(cè)

6、各組細(xì)胞增殖變化情況，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期變化情況；將帶有熒光素酶報(bào)告基因和HBV啟動(dòng)子基因的質(zhì)粒與PLSCR1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞，48h后收取細(xì)胞上清，檢測(cè)Gluc的活性，研究PLSCR1對(duì)HBV啟動(dòng)子的影響；將 HepG2細(xì)胞分為空白對(duì)照組、PCMV-HA組、HBV1.3組與HBV1.3+PLSCR1組、PLSCR1組，各組轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒，48h提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)半定量PCR檢測(cè)與HBV感染相關(guān)的

7、多個(gè)基因的mRNA表達(dá)水平的變化；將HepG2細(xì)胞分為空白對(duì)照組、PCMV-HA組、HBV1.3組與HBV1.3+PLSCR1組、PLSCR1組，各組轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒，48h提取細(xì)胞總蛋白，通過(guò)Western blot檢測(cè)Toll樣受體及其信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果：在 HepG2內(nèi)高表達(dá)PLSCR1可以抑制HBV的復(fù)制；經(jīng)過(guò)IFN處理的HBV陽(yáng)性細(xì)胞，采用PLSCR1的siRNA抑制PLSCR1的表達(dá)，降低了IFN

8、抑制HBV的作用，而且對(duì)細(xì)胞功能無(wú)顯著影響；通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建的含有 HBV啟動(dòng)子基因的螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體與PLSCR1共同轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞結(jié)果顯示PLSCR1可以抑制HBV啟動(dòng)子的表達(dá)，HepG2細(xì)胞中，PLSCR1可以逆轉(zhuǎn)多個(gè)HBV復(fù)制引起的細(xì)胞因子的變化；HBV1.3轉(zhuǎn)染HpeG2細(xì)胞后抑制了TLR9蛋白的表達(dá)，PLSCR1質(zhì)粒與HBV1.3質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染后 TLR9蛋白表達(dá)量恢復(fù)正常。
　　結(jié)論：PLSCR1在He