ASGPR介導(dǎo)的靶向siRNA抑制HBV的復(fù)制與表達(dá).pdf

1、目的：設(shè)計與構(gòu)建針對乙型肝炎病毒（HBV）基因的不同序列特異性siRNA載體，探討各si RNA對HepG2.2.15細(xì)胞HBV復(fù)制和表達(dá)的作用。篩選獲得具有高效沉默HBV的載體，以去唾液酸受體為靶點(diǎn)將其靶向HepG2.2.15細(xì)胞，觀察靶向與沉默效應(yīng)、以及對細(xì)胞活性的影響，為進(jìn)一步體內(nèi)靶向研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴特異性si RNA真核載體的構(gòu)建：設(shè)計并合成6對針對HBV基因的不同序列si RNA寡核苷酸，經(jīng)退火形成雙鏈，

2、然后經(jīng)T4連接酶連接，克隆入表達(dá)EGFP的真核載體，命名為pGenesil-siHBV1～6，并設(shè)立與HBV 序列無關(guān)的pGenesil-siHBV-HK作為陰性對照。⑵重組體的生物活性鑒定：將重組質(zhì)粒pGenesil-siHBV1～6和pGenesil-si HBV-HK 用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞。采用實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后2d、3d、4d靶基因的mRNA和細(xì)胞培養(yǎng)上清中cccDNA的水平；ELISA檢測轉(zhuǎn)染后2

3、d、3d、5d、7d細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg的表達(dá)。⑶去唾液酸受體的靶向作用：將具有高效沉默HBV的siRNA 載體利用j etPEI-Hepatocyte 靶向轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，倒置相差熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞內(nèi)EGFP的表達(dá)，檢測轉(zhuǎn)染效率；FCM檢測細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)以及轉(zhuǎn)染后3d細(xì)胞的凋亡；ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg的表達(dá)，細(xì)胞免疫化學(xué)酶標(biāo)技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)HBsAg

4、的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①HBV特異性siRNA載體的構(gòu)建：PCR、酶切及測序鑒定結(jié)果表明，針對HBV基因特異性的siRNA 真核載體構(gòu)建成功。②HBV特異性siRNA 載體的生物活性：Real time-PCR、ELISa分別從mRNA、蛋白質(zhì)和cccDNA 水平檢測，結(jié)果表明pGenesil-siHBV1～6均可不同程度的抑制HBV的復(fù)制和抗原的表達(dá)，其中pGenesil-siHBV1的抑制效果最強(qiáng)。③ASGPR 靶向pGen

5、esil-siHBV1對HBV的沉默效應(yīng)：將pGenesil-siHBV1利用j etPEI-Hepatocyte 靶向轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，倒置相差熒光顯微鏡下可見綠色熒光，而無j etPEI-Hepatocyte轉(zhuǎn)染對照組未見綠色熒光，F(xiàn)CM檢測綠色熒光陽性細(xì)胞約為45％；FCM檢測細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)以及ELISA檢測靶向?qū)嶒灲M細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg的表達(dá)低于Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染對