pSUPER載體介導(dǎo)的siRNA抑制肝癌多藥耐藥基因mrp1的表達(dá).pdf

1、目的:①構(gòu)建pSUPER-shRNA/mrp1的表達(dá)載體，為探討體內(nèi)、體外抑制肝細(xì)胞癌(Hepatocelluar carcinoma，HCC)多藥耐藥基因(Multidrug resitance，MDR)表達(dá)的方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。②觀察pSUPER-shRNA/mrp1對(duì)HepG2/mrp1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響作用，研究mrp1基因的功能。③探討pSUPER-shRNA/mrp1對(duì)HepG2/mrp1細(xì)胞MDR抑制作用及其作用的機(jī)理。④觀察p

2、SUPER-shRNA/mrp1對(duì)活體HepG2/mrp1細(xì)胞移植瘤的抑制作用及初步探討其毒副作用。 方法:從GenBank查mrp1基因序列，L05628，利用InvivoGen公司提供的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，尋找合適的siRNA靶序列，采用BLAST軟件，對(duì)選擇的靶序列進(jìn)行同源分析，排除非特異性地抑制其他基因片段的可能，從mrp1基因中選擇5段各21個(gè)堿基的特異性靶序列，分別設(shè)計(jì)5組寡核苷酸鏈，第5組是對(duì)

3、照組。每條寡核苷酸包括：兩端用于形成酶切位點(diǎn)的序列，兩個(gè)反向互補(bǔ)排列的21nt mrp1特異性序列，中央被一個(gè)9nt的間區(qū)隔開(kāi)，用于形成莖環(huán)結(jié)果，每條鏈64nt退火后形成兩端各帶Bgl Ⅱ、HindⅢ位點(diǎn)的dsRNA。將5組dsRNA分別重組到pSUPER載體構(gòu)建P1、P2、P3、P4、P5表達(dá)載體，PCR初步篩選重組子，質(zhì)粒測(cè)序確定堿基序列正確的重組載體。構(gòu)建成功后的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HepG2、HepG2/mrp1細(xì)胞株和皮下接種于裸鼠的

4、移植瘤。進(jìn)行一系列的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：①觀察轉(zhuǎn)染pSUPER-shRNA/mrp1對(duì)HepG2/mrp1細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；②用RT-PCR、Western blot雜交測(cè)定細(xì)胞mrp1基因轉(zhuǎn)錄后其mRNA的水平和MRPl蛋白表達(dá)水平；③流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)MRP1蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)柔紅霉素(DNR)積累量；④MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的耐藥性；⑤裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察HepG2、HepG2/mrp1細(xì)胞成瘤情況；⑥腫瘤治療實(shí)驗(yàn)，瘤內(nèi)注射pSUPE

5、R-shRNA/mrpl、pSUPER-shRNA/mrplnegative vectors，質(zhì)粒載體0.75mg/kg，和腹腔內(nèi)注射ADM1.5mg/kg，觀察裸鼠及腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤抑制率情況；⑦藥物毒副作用試驗(yàn)，檢測(cè)并比較轉(zhuǎn)染前后裸鼠肝腎功能及白細(xì)胞變化，并做心、肝、腎、肺組織解剖病理學(xué)檢查。 結(jié)果:①成功合成重組質(zhì)粒pSUPER-shRNk/mrp1載體P1、P2、P3、P4、P5并可以有效地進(jìn)行體外、動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染，說(shuō)明pS

6、UPER-shRNA/mrpl能直接細(xì)胞內(nèi)合成、表達(dá)siRNA，有好的穩(wěn)定性，以P4效果最好；②轉(zhuǎn)染pSUPER-shRNA/mrpl的HepG2/mrp1細(xì)胞，P4組mrp1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(88.03±2.04)％，多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1的表達(dá)量下降至(10.2±1.3)％，相對(duì)逆轉(zhuǎn)效率89.2％，細(xì)胞內(nèi)DNR積累量明顯增加；③成功建立裸鼠肝癌種植瘤模型，成瘤率均為100％；④裸鼠肝癌種植瘤經(jīng)轉(zhuǎn)染pSUPER-shRNA/m

7、rp1，ADM化療前后實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積差613.24±28.58mm<'3>，腫瘤生長(zhǎng)率(10.35±1.26)％，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[1120.04±90.76&(17.90±4.58)％，P<0.05]，腫瘤抑制率達(dá)45.0％；⑤D、E、F三組裸鼠均行肝腎功能及血液常規(guī)檢測(cè)，及心、肝、腎、肺病理學(xué)檢查。結(jié)果顯示，組間均無(wú)明顯差異，顯示pSUPER-shRNA/mrpl體內(nèi)轉(zhuǎn)染抑制HepG2/mrp1特定基因mrpl的表達(dá)，