MRP1參與粘液表皮樣癌多藥耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、無(wú)論是西方世界還是中國(guó),粘液表皮樣癌都是口腔以及頭頸部最常見(jiàn)的原發(fā)性唾液腺腫瘤[1,2,3]。粘液表皮樣癌占唾液腺所有腫瘤的10％,占唾液腺惡性腫瘤的35%[4]。在兒童患者中,粘液表皮樣癌更是占到了唾液腺所有腫瘤的16%,占唾液腺惡性腫瘤的51%[5]。根據(jù)腫瘤形態(tài)和腫瘤細(xì)胞特征,粘液表皮樣癌分為高度惡性粘液表皮樣癌,中度惡性粘液表皮樣癌,低度惡性粘液表皮樣癌。中度惡性粘液表皮樣癌和低度惡性粘液表皮樣癌一般情況下生存率很高,然而高度惡

2、性粘液表皮樣癌一般情況下預(yù)后很差,其五年生存率僅有30%左右[6,7]。粘液表皮樣癌通常對(duì)化療及放療均不敏感,手術(shù)切除一直是粘液表皮樣癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,化療僅用于無(wú)法完全切除的粘液表皮樣癌患者或者已經(jīng)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的粘液表皮樣癌患者,即便是這樣,粘液表皮樣癌患者的化療預(yù)后仍然不甚理想[8],并且頭頸部的腫瘤切除總會(huì)給患者帶來(lái)難以恢復(fù)的頭頸部疤痕和面部缺陷,極大的影響了患者的生活質(zhì)量并給患者帶來(lái)極大的心理創(chuàng)傷。因此提高粘液表皮樣癌的化療療效成為

3、當(dāng)務(wù)之急。本研究的目的就是通過(guò)研究粘液表皮樣癌的耐藥機(jī)制,找出粘液表皮樣癌耐藥的原因,從而為日后針對(duì)粘液表皮樣癌的治療打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　多藥耐藥相關(guān)蛋白(MPR1或ABCC1)一直以來(lái)被認(rèn)為是一個(gè)膜結(jié)合,能量依賴的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)子。隸屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白家族。多藥耐藥蛋白(MDR1或ABCB1)被首次發(fā)現(xiàn)后,所有人都認(rèn)為找到了治療腫瘤耐藥的關(guān)鍵分子,認(rèn)為多藥耐藥蛋白MDR1就是引起腫瘤耐藥的唯一轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。然而,在一個(gè)多藥耐藥小細(xì)胞

4、肺癌細(xì)胞系中[9]卻發(fā)現(xiàn)多藥耐藥蛋白(MDR1或ABCB1)沒(méi)有過(guò)表達(dá),過(guò)表達(dá)的是另一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—多藥耐藥相關(guān)蛋白MRP1,這是MRP1的首次發(fā)現(xiàn)。之后,大量報(bào)道發(fā)現(xiàn)MRP1的過(guò)表達(dá)可以預(yù)測(cè)多種血液和實(shí)體瘤化療的不良預(yù)后[10]。在腫瘤細(xì)胞中,盡管MRP1也被發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞質(zhì)中,但MRP1主要位于細(xì)胞膜上也表明將藥物從細(xì)胞內(nèi)泵到細(xì)胞外是MRP1導(dǎo)致多藥耐藥中的主要原因[11,12,13,14,15,16]。在正常組織中,MRP1主要位于細(xì)胞

5、基底外側(cè)面,用來(lái)將底物排入血液中[17]。MDR1和MRP1都屬于ATP結(jié)合蛋白超家族成員,并且都是和多藥耐藥高度相關(guān)的蛋白。人類MDR1在染色體7q21上,跨度100kb;人類MRP1在染色體16p13.1上,跨度為194kb,兩基因氨基酸序列相似度僅為15%。MDR1底物通常為中性疏水藥物或帶陽(yáng)性電荷的疏水藥物,而MRP1的底物通常為中性疏水藥物或帶陰性電荷的疏水藥物。與MDR1不同的是,MRP1也可以轉(zhuǎn)運(yùn)谷胱甘肽及谷胱甘肽的藥物結(jié)

6、合物[18]。雖然對(duì)MRP1的研究很多,但是MRP1的晶體結(jié)構(gòu)和它的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制仍然不甚明了[19],并且腫瘤中的MRP1由于其廣泛存在基因多態(tài)性和變異,使得MRP1的功能更加難以預(yù)測(cè)[20,21].
　　本次研究中,我們?cè)谡骋罕砥影┘?xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)了核MRP1的存在,并證明了MRP1的核轉(zhuǎn)運(yùn)和粘液表皮樣癌的多藥耐藥的相關(guān)性。為研究MRP1在粘液表皮樣癌細(xì)胞中是如何發(fā)揮多藥耐藥作用的,我們利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)MRP1表達(dá),并發(fā)現(xiàn)MD

7、R1的表達(dá)也相應(yīng)的下降了。我們通過(guò)免疫組化技術(shù)檢測(cè)了MDR1和MRP1在127例粘液表皮樣癌患者腫瘤樣本中的的蛋白表達(dá),也發(fā)現(xiàn)二者之間的正相關(guān)關(guān)系。通過(guò)免疫組化檢測(cè)組織芯片,發(fā)現(xiàn)MRP1的核表達(dá)并未在其他正常組織和腫瘤組織中出現(xiàn)。為了證明MDR1的下調(diào)確實(shí)是由MRP1的下調(diào)引起,我們通過(guò)熒光素酶報(bào)告分析技術(shù)最終證明了MRP1下調(diào)后,通過(guò)改變MDR1基因啟動(dòng)子的活性,從而引起MDR1的表達(dá)量改變。綜上所述,我們認(rèn)為MRP1的新功能可能為將

8、來(lái)粘液表皮樣癌的臨床個(gè)體化治療提供新的靶點(diǎn)。
　　第一部分 MRP1下調(diào)引起粘液表皮樣癌多藥耐藥細(xì)胞系耐藥性下降
　　目的:研究MRP1在粘液表皮樣癌多藥耐藥中所發(fā)揮的作用。
　　材料和方法:高轉(zhuǎn)移粘液表皮樣癌細(xì)胞系MC3和由其使用五氟尿嘧啶沖擊療法誘導(dǎo)而出的多藥耐藥細(xì)胞系MC3/5FU由本實(shí)驗(yàn)室建系并保存。合成針對(duì)MRP1的shRNA,并篩選出被其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MC3/5FU細(xì)胞系。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

9、來(lái)檢測(cè)RNA的表達(dá),蛋白質(zhì)印跡(Western blot)用來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)的改變。甲基噻唑基四唑試驗(yàn)(MTT assay)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞耐藥性的改變。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL staining)用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。數(shù)據(jù)結(jié)果使用Student’s t-test and one-way ANOVA(LSD)來(lái)計(jì)算對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異顯著性。計(jì)算由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS version12.0完

10、成。P<0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:MRP1的下調(diào)顯著提高了多藥耐藥細(xì)胞系MC3/5FU的對(duì)五氟尿嘧啶(5FU),阿霉素(ADM),表阿霉素(PADM),博來(lái)霉素-A5(BLM-A5),順鉑(CDDP)和紫杉醇(TAX)的化學(xué)敏感性,在一定5FU濃度下,MRP1的下調(diào)顯著抑制了MC3/5FU細(xì)胞的生長(zhǎng)并顯著增加了其凋亡。
　　結(jié)論:MRP1在粘液表皮樣癌的多藥耐藥中發(fā)揮著重要作用。
　　第二部分.MRP1的核轉(zhuǎn)位

11、參與粘液表皮樣癌的多藥耐藥性改變
　　目的:檢測(cè)MRP1的核轉(zhuǎn)移是否與粘液表皮樣癌的多藥耐藥性的改變相關(guān)。
　　材料和方法:免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法進(jìn)行細(xì)胞染色后,使用激光共聚焦顯微鏡用來(lái)檢測(cè)MRP1的亞細(xì)胞分布。免疫熒光組織化學(xué)法來(lái)檢測(cè)MRP1在粘液表皮樣癌腫瘤組織中和正常腮腺組織中的表達(dá)以及定位,并通過(guò)免疫化學(xué)組織染色法來(lái)對(duì)組織芯片染色,從而檢測(cè)MRP1在其他正常組織和其他腫瘤組織中的表達(dá)和定位。Student’s t-t

12、est and one-way ANOVA(LSD)用來(lái)計(jì)算對(duì)比改變的顯著性以及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異。計(jì)算由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS版本12.0完成,P<0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡的方法,在RNA以及蛋白水平,對(duì)比MRP1在多藥耐藥細(xì)胞系MC3/5FU中和其親代細(xì)胞MC3中的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)MRP1的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生量的變化。但是當(dāng)我們下調(diào)MRP1在MCA/5FU細(xì)胞中的表達(dá)后,細(xì)胞的多藥耐藥性卻明顯下降

13、了。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色進(jìn)行蛋白定位后發(fā)現(xiàn)MRP1從MC3細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到了MC3/5FU細(xì)胞的細(xì)胞核中,而且MC3/5FU細(xì)胞中下調(diào)的MRP1主要為細(xì)胞核中的MRP1。為檢測(cè)核MRP1是否也出現(xiàn)在其他組織或者腫瘤中,也為了檢測(cè)是否為MRP1的一抗的非特異性染色才使得MRP1出現(xiàn)在細(xì)胞核中,我們用相同的一抗對(duì)組織芯片在相同條件下進(jìn)行免疫化學(xué)染色,結(jié)果我們并未發(fā)現(xiàn)MRP1在其他正常組織或者腫瘤組織中有核表達(dá)。
　　結(jié)論:

14、 MRP1的核轉(zhuǎn)移參與粘液表皮樣癌的多藥耐藥性改變。MRP1的核轉(zhuǎn)移可能是MRP1引發(fā)耐藥的新機(jī)制,基于這個(gè)新機(jī)制可能開(kāi)發(fā)出新的粘液表皮樣癌治療方法。核MRP1可能為粘液表皮樣癌所特有,其有潛質(zhì)來(lái)成為鑒別診斷粘液表皮樣癌的一個(gè)Marker。
　　第三部分下調(diào)MRP1的表達(dá)導(dǎo)致MDR1表達(dá)的下降
　　目的:研究核MRP1是通過(guò)何種機(jī)制來(lái)參與粘液表皮樣癌的多藥耐藥的。
　　材料和方法:從第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院病理科收集127

15、例常規(guī)手術(shù)治療粘液表皮樣癌患者的腫瘤組織樣本,患者手術(shù)時(shí)間均在2006年至2011年。用免疫組織化學(xué)染色來(lái)檢測(cè)MRP1和MDR1在粘液表皮樣癌組織中的的表達(dá)。染色程度由蔡卜磊博士和劉園博士分別檢測(cè)。結(jié)果通過(guò)定性的方法結(jié)合定量的方法檢測(cè)。為排除MRP1表達(dá)在細(xì)胞核膜上的可能性,利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行分層掃描進(jìn)行蛋白定位。RT-PCR用來(lái)檢測(cè)RNA表達(dá)量的改變。Western blot用來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)的改變。Student’s t-tes

16、t and one-way ANOVA(LSD)用來(lái)計(jì)算對(duì)比改變的顯著性。斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)分析來(lái)分析MDR1表達(dá)量和MRP1表達(dá)量的相關(guān)性。計(jì)算由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS version12.0完成,P<0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:為了排除MRP1一抗特異性的問(wèn)題,我們從另一家公司購(gòu)買(mǎi)了新的MRP1一抗來(lái)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果我們?cè)俅未_認(rèn)MRP1出現(xiàn)在粘液表皮樣癌的細(xì)胞核中。聚合酶鏈反應(yīng)以及免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在下調(diào)MRP1的表

17、達(dá)后,MDR1的表達(dá)也明顯降低。通過(guò)分析127例粘液表皮樣癌患者的腫瘤樣本相同位置的MRP1表達(dá)和MDR1表達(dá)及定位,再次確認(rèn)發(fā)現(xiàn)MRP1的表達(dá)量與MDR1的表達(dá)量有明顯正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:在粘液表皮樣癌腫瘤中MRP1的表達(dá)量與MDR1的表達(dá)量顯著正相關(guān)。
　　第四部分核MRP1通過(guò)降低MDR1啟動(dòng)子的活性來(lái)調(diào)節(jié)MDR1的表達(dá)
　　目的:初步探索MRP1對(duì)MDR1表達(dá)通路中的影響
　　材料和方法:shRNA瞬

18、時(shí)轉(zhuǎn)染MC3/5FU細(xì)胞系下調(diào)MRP1的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)用來(lái)檢測(cè)RNA的表達(dá),免疫印跡法用來(lái)檢測(cè)蛋白表達(dá)的改變。熒光素酶報(bào)告分析(luciferase reporter assays)檢測(cè)MDR1啟動(dòng)子活性。Student’s t-test and one-way
　　ANOVA(LSD)用來(lái)計(jì)算對(duì)比改變的顯著性。計(jì)算由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS version12.0完成,P<0.05為有顯著差異。
　　結(jié)果:瞬時(shí)轉(zhuǎn)染shR