發(fā)夾狀RNA抑制ATO耐藥的白血病K562-AS2細胞MRP1基因表達的實驗研究.pdf

1、[目的]: 探討發(fā)夾狀RNA（shRNA）通過轉(zhuǎn)染ATO耐藥的白血病細胞株K562/AS2對MRP1基因表達的抑制作用。 [方法]: 本實驗設(shè)計包括兩個部分：第一部分，設(shè)計并合成3條針對MRP1基因的shRNA序列，在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染K562/AS2細胞，用熒光實時定量PCR分析MRP1 mRNA的表達水平，流式細胞儀檢測MRP1蛋白表達和細胞內(nèi)柔紅霉素累積量；第二部分，根據(jù)第一部分實驗結(jié)果，篩選出來其中一條對

2、MRP1基因抑制效果最佳的shRNA序列，將其構(gòu)建到質(zhì)粒表達載體中，經(jīng)酶切鑒定分析和測序，分析MRP1干擾質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。 [結(jié)果]: 第一部分：用帶熒光標記的非特異性shRNA轉(zhuǎn)染細胞后，流式細胞儀檢測得轉(zhuǎn)染效率為（76.17±1.57）%；經(jīng)MRP1-shRNA作用24h后，K562/AS2細胞株中MRP1 mRNA和蛋白表達水平分別最大下調(diào)幅度為（79.1±0.07）%和（62.48±0.86）%（P<0.05）

3、，同時細胞內(nèi)柔紅霉素累積量顯著增加（P<0.05），其中MRP1-shRNA b干擾序列對MRP1基因表達抑制效果最為明顯。 第二部分：將MRP1-shRNA b干擾序列構(gòu)建到質(zhì)粒pGenesil-1.1上，經(jīng)酶切鑒定及測序分析，質(zhì)粒pGenesil-1.1-MRP1-shRNA b符合設(shè)計要求，MRP1基因干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。此質(zhì)粒同時具有G418抗性基因和卡那霉素抗性基因以及EGFP報告基因。 [結(jié)論]： M