RNA干擾沉默急性白血病JARID1B基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60的JARID1B表達(dá)，研究JARID1B基因干擾對HL-60細(xì)胞增殖和凋亡以及對組蛋白甲基化、乙?；揎椀挠绊懀綄ぐ籽』蛑委煹男路椒?。
　　 方法：（1）設(shè)計(jì)四個(gè)針對JARID1B基因的小干擾RNA片段，經(jīng)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，RT-PCR的方法篩選出最佳干擾片段

2、。（2）應(yīng)用四唑鹽（MTT）法繪制細(xì)胞生長曲線，觀察JARID1B siRNA對HL-60細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞的凋亡。（3）Western blot檢測JARID1B siRNA作用后凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、 procaspase-9、procaspase-3、C-myc及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白P27表達(dá)水平的變化、組蛋白H3K4甲基化及組蛋白H3、H4乙酰化狀態(tài)變化。
　　 結(jié)果：（1）轉(zhuǎn)染8小時(shí)后，轉(zhuǎn)染

3、效率高達(dá)93％±2.56％，采用RT-PCR法篩選出最佳的siRNA為JARID1B-1509，其序列為Sense5'-GGAGCUAUUCAAUU AACUATT-3' Anti-sense5'-UAGUUAAUUGAAUAGCUCCAG-3'。（2）JARID1B siRNA致HL-60細(xì)胞原癌基因c-myc的表達(dá)下降，P27的表達(dá)上調(diào)，抑制HL-60細(xì)胞的增殖，作用24小時(shí)半數(shù)抑制濃度（IC50）約為60nM，且隨著濃度增加、作用

4、時(shí)間延長，抑制率也逐漸上升。（3）JARID1B siRNA可引起HL-60細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、 procaspase-9、procaspase-3改變，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，且隨著濃度的增加，凋亡率也逐漸上升。（4）JARID1B siRNA可引起HL-60細(xì)胞的JARID1B蛋白及JARID1B mRNA表達(dá)水平的降低，同時(shí)組蛋白H3K4甲基化水平增加及組蛋白H3的乙?；揭采晕⑸险{(diào)，組蛋白H4的乙?；綗o顯著變化。
　　

5、 結(jié)論：（1）LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)JARID1B siRNA導(dǎo)入HL-60細(xì)胞具有轉(zhuǎn)染率高、方法簡便等特點(diǎn)。（2） 運(yùn)用RNAi技術(shù)，可以有效地干擾HL-60細(xì)胞中JARID1B的表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，使得RNAi技術(shù)有望成為白血病靶向基因治療的新工具，同時(shí)JARID1B基因也可以成為白血病靶向基因治療的新靶點(diǎn)。（3）JARID1B siRNA能夠上調(diào)組蛋白H3K4甲基化和組蛋白H3乙酰化，對