急性髓細(xì)胞白血病FOXC1基因與ERG基因異常表達(dá)的意義研究.pdf

1、急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）是一組高度異質(zhì)性疾病，根據(jù)預(yù)后因素分組進(jìn)行分層治療是當(dāng)前治療的總趨勢(shì)。目前對(duì)其預(yù)后分級(jí)的主要標(biāo)準(zhǔn)為染色體核型分析，但是，仍有超過(guò)45％的AML患者為正常核型而被歸于中度危險(xiǎn)組，這部分患者預(yù)后仍有較大不同。因此，有必要對(duì)急性髓細(xì)胞白血病進(jìn)行更精細(xì)危險(xiǎn)度分級(jí)。近年研究證明，某些分子生物學(xué)異常與急性髓細(xì)胞白血病發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有密切關(guān)系，能顯著影響AML患者臨床結(jié)局，可能成為危險(xiǎn)度分層和評(píng)價(jià)預(yù)后的指標(biāo)之一。

2、本研究運(yùn)用定性及實(shí)時(shí)定量RT—PCR方法檢測(cè)急性髓細(xì)胞白血病患者ERG基因與FOXC1基因表達(dá)，分析急性髓細(xì)胞白血病患者治療前后FOXC1、ERG基因表達(dá)水平變化及FOXC1、ERG基因表達(dá)水平與臨床特點(diǎn)、治療反應(yīng)的關(guān)系，初步評(píng)價(jià)它們對(duì)AML患者的臨床意義和預(yù)后指導(dǎo)作用。 研究目的： 1、觀察急性髓細(xì)胞白血病患者FOXC1基因及ERG基因的表達(dá)水平。 2、探討FOXC1基因及ERG基因的表達(dá)水平在急性髓細(xì)胞白血病

3、中的臨床意義。 材料與方法： 1、研究對(duì)象 2006年5月～2009年3月在我科住院診治的經(jīng)臨床、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)檢查確診的初發(fā)或復(fù)發(fā)AML患者53例，男性21例，女性32例，中位年齡35歲。經(jīng)誘導(dǎo)化療獲完全緩解（CR）的AML患者15例，設(shè)10名健康體檢志愿者外周血標(biāo)本作對(duì)照組。 2、方法 2．1分組設(shè)計(jì) 將研究對(duì)象分為初發(fā)/復(fù)發(fā)AML病例組、完全緩解組、正常對(duì)照組，觀察各組中ER

4、G和FOXC1的表達(dá)情況。 2．2單個(gè)核細(xì)胞的分離和總RNA提取 標(biāo)本肝素抗凝，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞，Trizol—異丙醇/氯仿法提取總RNA?？俁NA經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，用核酸蛋白分析儀檢測(cè)其純度和濃度。 2．3 RT—PCR檢測(cè)ERG、FOXC1 mRNA的表達(dá) 2．3．1 cDNA合成 取RNA2μ g經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，—20℃?zhèn)?/p>

5、用。 2．3．2 PCR擴(kuò)增及定性檢測(cè) 設(shè)計(jì)合成引物，以cDNA為模板分別擴(kuò)增ERG、FOXC1和內(nèi)參照GAPDH的相應(yīng)基因序列片斷。PCR產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)掃描成像。 2．3．3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ERG、FOXC1的表達(dá)水平 應(yīng)用SYBR Green熒光染料技術(shù)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，數(shù)據(jù)由熒光定量PCR儀自動(dòng)收集，計(jì)算機(jī)分析Ct值，用△Ct代表ERG、FOXC1 mRNA轉(zhuǎn)

6、錄量的相對(duì)水平，△Ct越大，mRNA表達(dá)水平越低。 2．3．4 PCR產(chǎn)物測(cè)序鑒定 部分PCR產(chǎn)物送測(cè)序，將結(jié)果提交BLAST比對(duì)證實(shí)。 2．3．5 AML患者核型檢測(cè) 患者的核型由本科血液病實(shí)驗(yàn)室采用R顯帶技術(shù)檢測(cè)。無(wú)菌取患者骨髓2～3ml，分離單個(gè)核細(xì)胞，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)16h后加0．05μg/ml秋水仙酰胺，阻留中期分裂相并收集細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定后制片，經(jīng)Earles液處理、Giemsa染色后鏡檢，分析

7、核型。 2．4患者臨床資料分析 2．4．1分析患者的臨床特點(diǎn)相關(guān)的信息，包括年齡、性別、AL亞型、初診時(shí)血細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓/外周血原始細(xì)胞比例、核型等。 2．4．2 AML患者ERG、FOXC1的表達(dá)水平與治療反應(yīng)關(guān)系 非M3型AML患者采用標(biāo)準(zhǔn)DA3+7化療方案誘導(dǎo)緩解治療。復(fù)發(fā)AML患者采用TA、IA或MA等化療方案治療。常規(guī)化療2療程觀察患者治療反應(yīng)，療效判定參照張之南等主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》

8、。 2．5數(shù)據(jù)處理 SPSS13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用x±SD表示，組間表達(dá)水平的比較用t檢驗(yàn)，組間表達(dá)率、緩解率的比較用卡方檢驗(yàn)和Fisher精確概率檢驗(yàn)。P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、初發(fā)/復(fù)發(fā)急性髓細(xì)胞白血病患者ERG基因有較高的陽(yáng)性表達(dá)，并有較高的表達(dá)水平；FOXC1基因表達(dá)水平低。提示急性髓細(xì)胞白血病患者ERG基因及FOXC1基因存在表達(dá)異常。 2、ERG高