ERG基因和BAALC基因在正常核型急性髓系白血病中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、目的：
　　 白血病是一組基因組發(fā)生動(dòng)態(tài)變化的異質(zhì)性造血干/祖細(xì)胞疾病，以異常造血細(xì)胞的惡性增殖、分化受阻、凋亡受抑制并造成正常血細(xì)胞減少為特征。大約45％的急性髓系白血病患者在常規(guī)染色體核型分析時(shí)檢測不到染色體畸變，為正常核型，但這種亞型的患者在分子遺傳變異和治療效果上存在異質(zhì)性。亞顯微上的遺傳學(xué)損傷不僅與疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，還影響其治療反應(yīng)性和生存率。在正常核型急性髓系白血病（CN-AML）中常見的分子畸變有核磷蛋白（NPM

2、）基因突變和fms樣酪氨酸激酶3（FLT3）基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)（ITDs）。在低比例的CN-AML患者中也發(fā)現(xiàn)其他分子異常，包括預(yù)示良好預(yù)后的CEBPA（CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α）基因突變以及MLL基因部分串聯(lián)重復(fù)（MLL，-PTDs）。
　　 近來，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測定出一些基因（ERG，BAALC等）表達(dá)水平定量上的差別，為CN-AML的預(yù)后提供了重要的信息。然而，這些危險(xiǎn)因素間的相互關(guān)系和相對重要性研究還較為少見。

3、本文我們利用熒光定量PCR技術(shù)聯(lián)合檢測一組具有典型特征的CN-AML患者ERG基因和BAALC基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而探討不同分子標(biāo)記與預(yù)后的關(guān)系以及他們之間的相互關(guān)系，為這部分患者進(jìn)一步精細(xì)分型進(jìn)而分層治療提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液病治療中心2008年1月-2009年1月住院的初治急性髓系白血病患者（62例）EDTA抗凝骨髓液（各3-5m1），其中男

4、30例，女32例，年齡在20-77歲之間，中位年齡54.5歲。所有病例經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)免疫分型及PCR融合基因檢測確診為AML（FAB），染色體分析采用R顯帶技術(shù)，至少分析20個(gè)克隆，均未檢測到核型異常。其中包括：M01例，M13例，M219例，M411例，M524例，M64例；20例非惡性血液病患者作為正常對照。實(shí)驗(yàn)組患者接受誘導(dǎo)緩解方案或強(qiáng)烈化療方案。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 抗凝骨髓液經(jīng)Fi

5、coll-Hypaque密度梯度離心分離單個(gè)核細(xì)胞（MNC）；提取細(xì)胞總RNA；配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μl合成cDNA；引物由Takara公司設(shè)計(jì)合成，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR SYBR Green Ⅰ方法檢測ERG和BAALC mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參照。
　　 三、結(jié)果判斷
　　 將標(biāo)準(zhǔn)品cDNA10倍濃度梯度稀釋為5-6個(gè)濃度梯度，各取2μl作為模板進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)，由各擴(kuò)增曲線得到

6、的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到樣本的拷貝數(shù)。以GAPDH作為內(nèi)參照，ERG和BAALC作為目的基因，通過目的基因和內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比值進(jìn)行樣本間相對定量的比較。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法
　　 應(yīng)用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分別以患者ERG基因相對表達(dá)量第75百分位數(shù)（P75）和BAALC基因相對表達(dá)量中位數(shù)為界，分為高表達(dá)和低表達(dá)2組，對于分類變量資料應(yīng)用X2檢驗(yàn)，對于連續(xù)變量資料應(yīng)用Mann-Whime

7、y U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行生存分析，相互比較使用Log-rank檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、方法的可靠性和準(zhǔn)確性
　　 （1）RNA的純度和質(zhì)量分析
　　 所提取的總RNA經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，OD260/OD280在1.8-2.0之間，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，28S和18S條帶清晰可見，說明總RNA無明顯降解。
　　 （2

8、）擴(kuò)增的特異性及定量的準(zhǔn)確性
　　 標(biāo)準(zhǔn)品cDNA經(jīng)梯度稀釋后進(jìn)行PCR 反應(yīng)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（r2）均>0.998，斜率在-3.3至-3.5之間，反映定量準(zhǔn)確，擴(kuò)增效率良好。擴(kuò)增后熔解曲線顯示銳利的單一峰，熔解溫度均一，說明擴(kuò)增產(chǎn)物均一，無非特異擴(kuò)增及引物二聚體。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增片段的均一性及長度。
　　 2、ERG和BAALC基因在正常核型急性髓系白血病中的表達(dá)
　　 CN-

9、AML組ERG基因及BAALC基因表達(dá)均顯著高于非惡性血液病組（P值均小于0.05）。
　　 3、ERG和BAALC基因與正常核型急性髓系白血病患者臨床資料的關(guān)系
　　 （1）ERG基因高表達(dá)組患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高（P<0.05），骨髓原始細(xì)胞比例較高（P<0.05），F(xiàn)AB分型中M0/M1比例偏高。
　　 （2）BAALC基因高表達(dá)組患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)增高（P<0.05），CD34表達(dá)率較高（P<0.05），F(xiàn)AB分

10、型中M0/M1比例偏高。
　　 4、ERG和BAALC基因與正常核型急性髓系白血病預(yù)后的關(guān)系
　　 ERG和BAALC基因高表達(dá)組患者CR率顯著低于低表達(dá)組（40％vs 74％；P<0.05，46％vs 79％；P<0.05），ERG和BAALC基因高表達(dá)組一年OS率顯著低于低表達(dá)組（33％vs 69％；P<0.05，36％vs 72％；P<0.05）。
　　 5、ERG和BAALC基因表達(dá)相互關(guān)系及與預(yù)后的關(guān)系

11、
　　 在BAALC基因低表達(dá)的情況下，高水平的ERG預(yù)示著低的OS率（P<0.05），而BAALC高表達(dá)時(shí)，高表達(dá)的ERG對預(yù)后則無明顯影響（P>0.05）。
　　 ERG和BAALC均低表達(dá)的患者一年OS率高于ERG或/和BAALC高表達(dá)組患者（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、CN-AML患者ERG基因和BAALC基因表達(dá)水平顯著高于非惡性血液病患者。
　　 2、ERG基因和BAAL