IDH基因表達在成人急性髓細胞白血病中的臨床意義及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行了論述。
　　第一部分 IDH基因表達在成人核型正常急性髓細胞白血病中的預后分析
　　目的:探討IDH基因mRNA表達與CN-AML患者預后的關系。
　　方法:采用實時熒光定量PCR技術檢測我院232例初發(fā)核型正常的急性髓細胞白血?。–N-AML）患者的骨髓單個核細胞、11例正常對照骨髓CD34+細胞和20例正常對照外周血單個核細胞中IDH1和IDH2基因mRNA表達水平;同時應用PCR后直接測

2、序方法檢測CN-AML患者和正常對照的IDH1、IDH2、NMP1、FLT3-ITD、DNMT3A和CEBPA突變。比較IDH1和IDH2基因mRNA表達水平在CN-AML患者和正常對照之間的差異。分析IDH1和IDH2基因mRNA表達水平與CN-AML患者總體生存(OS)、無事件生存(EFS)和無復發(fā)生存（RFS）的關系;并分析IDH1和IDH2基因mRNA表達水平與其它臨床指標和基因突變的關系。
　　結果:
　　1、與正

3、常對照相比，CN-AML患者IDH1基因mRNA表達水平高于正常對照骨髓CD34+細胞和正常對照外周血單個核細胞，p值分別為0.01和＜0.001;CN-AML患者IDH2基因mRNA表達水平高于正常對照外周血單個核細胞P＜0.001。
　　2、采用Kaplan-Meier分析，IDH1基因mRNA低表達組患者3年的OS和EFS分別為50％和31％，IDH1基因mRNA高表達組患者3年的OS和EFS分別為26％和16％，IDH1基

4、因mRNA低表達組的預后明顯優(yōu)于高表達組，其OS和EFS的P值均＜0.001。而IDH2基因mRNA表達與CN-AML患者預后沒有關系，0S、EFS和RFS差異均無統(tǒng)計學意義，p值均＞0.05。
　　3、用Cox回歸模型糾正年齡、白細胞數(shù)、基因突變等因素，IDH1基因mRNA低表達組的預后明顯優(yōu)于高表達組，其OS和EFS的P值均＜0.001。IDH1基因mRNA高表達是CN-AML患者的預后因素，IDH1基因mRNA高表達者預后差

5、。
　　4、通過分析IDH1基因mRNA表達與臨床指標和基因突變關系發(fā)現(xiàn):IDH1基因mRNA高表達主要集中M5患者中，其高表達與DNMT3A突變有關系，在DNMT3A突變患者中高表達者占16％，低表達者占5％，兩者差異具有統(tǒng)計學意義，P=0.007;IDH1基因mRNA高表達與CEBPA雙突變有關系，在CEBPA雙突變患者中高表達者占7％，低表達者占17％，兩者差異具有統(tǒng)計學意義，P=0.019。
　　結論:
　　我

6、們首次發(fā)現(xiàn)IDH1基因mRNA高表達是獨立于臨床指標和高頻基因突變的預后不良的標志物，IDH1基因mRNA表達水平可作為臨床預后危險分層。
　　第二部分 IDH1基因表達在成人急性髓細胞白血病中的機制研究
　　目的:(1)探索IDH1基因在AML中的作用機制;(2)尋找調控IDH1基因mRNA表達的microRNA。
　　方法:
　　(1)采用siRNA干擾方法沉默THP-1和HL-60/ADR細胞的IDH1基因

7、，MTT法、流式細胞術檢測其對生長、周期和凋亡影響，western blot檢測凋亡和信號通路蛋白變化。
　　(2)根據(jù)IDH1基因mRNA表達量高低從CN-AML中挑選16個患者標本，IDH1基因mRNA高表達和低表達各8例，采用Agilent Microarray芯片(SBC HumanmiRNA Microarray Release16.0)進行microRNA表達譜芯片分析，尋找與IDH1基因mRNA表達相關的microR

8、NA。熒光定量PCR檢測CN-AML患者的microRNA變化，對芯片結果進行驗證。
　　結果:
　　(1)沉默THP-1細胞IDH1基因后，小干擾組細胞生長明顯低于陰性對照組（p=0.04）;小干擾組48小時凋亡率為37.22±8.27％，明顯高于陰性對照組19.50±1.18％(p=0.021)，并伴隨Caspase-3和PARP剪切帶增加，PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制，但是小干擾組細胞與陰性對照組細胞相比，周

9、期變化差異無統(tǒng)計學意義（p=0.89）。
　　(2)沉默THP-1細胞IDH1基因后給予臨床常用化療藥物如:HHT、ACR和DNR，能增加這些藥物對THP-1細胞的敏感性。
　　(3)沉默HL-60ADR細胞IDH1基因48小時后，Caspase-3和PARP剪切帶增加，PI3K/AKT信號通路抑制，能部分逆轉HL-60/ADR對阿霉素的耐藥。
　　(4)芯片結果顯示:IDH1基因mRNA高表達組的患者中miR-181

10、家族(miR-181a、miR-181a-2、miR-181b、miR-181c*、miR-181c、miR-181a*和miR-181d)、miR-146a、miR-128、miR-625、miR-25和miR-335低表達，miR-4286、miR-660、miR-107和miR-324-5p高表達，而在IDH1基因mRNA低表達組的患者中上述microRNAs表達相反。
　　(5)熒光定量PCR也證實了在IDH1基因mRNA

11、高表達組的患者miR-181d和miR-181b低表達，miR-4286高表達;而在IDH1基因mRNA低表達組的患者中上述microRNA表達相反。
　　結論:
　　(1)下調IDH1基因表達能降低AML細胞株的增殖，導致細胞凋亡，增加化療藥物的敏感性和逆轉耐藥。
　　(2)在CN-AML患者中miR-181家族（miR-181d和miR-181b）起到抑癌基因作用，可能抑制IDH1基因mRNA的表達，miR-428