應(yīng)用小RNA及RNA干擾研究慢性髓性白血病的致病機(jī)理.pdf

1、慢性髓性白血病(CML)是一種起源于骨髓多能造血干細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病，由染色體易位而形成的Bcr-Abl融合基因及其編碼的蛋白質(zhì)是CML的發(fā)病基礎(chǔ)，也是對白血病進(jìn)行分子治療的主要藥靶。但是Bcr-Abl在疾病發(fā)生中的地位和作用機(jī)制還沒有完全揭示，該疾病的發(fā)生是一個涉及多基因、復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)的綜合作用結(jié)果。為了找到更多有潛力的分子治療藥靶，我們利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)和miRNA調(diào)控思路對CML的致病機(jī)理進(jìn)行研究。

2、 以k562細(xì)胞作為CML研究的模型，確立了Bcr-Abl、Abl、Erk1、Gab2和Lyn為所要研究的基因。首先通過RT-PCR驗證了它們的表達(dá)水平。然后設(shè)計并化學(xué)合成了能同時靶向Bcr-Abl和Abl基因的siRNA分子。通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染k562細(xì)胞，在此過程中調(diào)整轉(zhuǎn)染參數(shù)，24或48小時后進(jìn)行半定量RT-PCR分析，結(jié)果顯示：Bcr-Abl和Abl基因完全下調(diào)后(100％)，Erk1也完全下調(diào)(100％)，Gab2的抑制率接近5

3、0％，而Lyn基因沒有明顯的抑制效果。當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量時，這種抑制趨勢相同，但呈現(xiàn)劑量依賴的方式。提示這些基因在轉(zhuǎn)錄(后)水平上具有相關(guān)性。多次實驗的綜合結(jié)果也顯示，siRNA的設(shè)計和有效作用濃度是RNAi過程中兩個關(guān)鍵的參數(shù)。 將生物信息學(xué)手段和miRNA領(lǐng)域的研究理論相結(jié)合，來探索以上現(xiàn)象的潛在原因。利用EMBL數(shù)據(jù)庫的ClustalW分析啟動子區(qū)時發(fā)現(xiàn)Bcr-Abl、Gab2和Erk1，在轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 kb左右的位置具

4、有很好的同源性，同源區(qū)域大約250 bp左右，保守性為80％。而Lyn與它們?nèi)叩耐葱圆睢＿M(jìn)一步研究選取Gab2的269 bp保守區(qū)域進(jìn)行研究，通過mfold折疊獲得RNA結(jié)構(gòu)圖，發(fā)現(xiàn)-80～-150之間的一段區(qū)域具有明顯的miRNA前體特征，30 nt的環(huán)，21和17 nt的臂。其中21 nt的臂在長度上符合成熟miRNA的要求，以該序列作為進(jìn)一步研究對象，開展后續(xù)研究。 合成寡聚核苷酸探針，用miRNA提取試劑盒來富集小片

5、段的RNA。進(jìn)行northern雜交工作。在此過程中摸索了探針標(biāo)記、雜交、洗膜和成像過程，獲得了miRNA前體的陽性條帶。但要獲得成熟miRNA的信息，并保證結(jié)果的穩(wěn)定性，有必要進(jìn)一步優(yōu)化實驗操作。 為了研究這個潛在的miRNA的功能作用，構(gòu)建與之相應(yīng)的表達(dá)載體。合成兩條能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的核苷酸序列，其中的臂與miRNA的序列相應(yīng)。將單鏈DNA退火后，連入U6啟動子驅(qū)動的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGre