植物病毒衛(wèi)星RNA干擾其輔助病毒致病性的分子機(jī)理.pdf

1、植物RNA病毒常常伴隨有小的衛(wèi)星RNA。衛(wèi)星RNA是一類小的非編碼RNA，基因組大小為200-1500nt，通常不編碼蛋白，完全依賴于輔助病毒來完成復(fù)制、包被、移動(dòng)和傳播，且和其輔助病毒的基因組不存在序列同源性。部分衛(wèi)星RNA可以影響輔助病毒在寄主植物上誘發(fā)的癥狀，多數(shù)為減輕，少數(shù)會(huì)加重寄主癥狀。傳統(tǒng)理論認(rèn)為衛(wèi)星RNA是通過與輔助病毒競(jìng)爭(zhēng)復(fù)制酶，減少了輔助病毒的復(fù)制，從而減輕了寄主癥狀。然而，傳統(tǒng)理論不能解釋衛(wèi)星RNA在減輕輔助病毒誘導(dǎo)

2、癥狀的同時(shí)，部分輔助病毒復(fù)制量不受影響的現(xiàn)象。由此推測(cè)，衛(wèi)星RNA可能存在其它途徑來減輕輔助病毒誘導(dǎo)的癥狀。
　　 RNA沉默(或稱為RNAi)是一種廣泛存在于真核生物中，由小RNA介導(dǎo)的、以序列特異性的方式抑制或破壞靶標(biāo)基因表達(dá)，在DNA或轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機(jī)制。RNA沉默可以調(diào)控基因的表達(dá)、修飾DNA和特異染色體區(qū)域組蛋白的表觀遺傳、防御轉(zhuǎn)座子和病毒等核酸的入侵。病毒為了成功侵染寄主，也進(jìn)化了相應(yīng)的反防衛(wèi)機(jī)制。大部分是通過編碼

3、基因沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing，VSR)蛋白結(jié)合病毒的siRNA，阻止RNA沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)的形成，抑制病毒基因組的降解。
　　 基于RNA沉默具有調(diào)控植物正常生長發(fā)育和防御病毒的功能、VSR具有干擾RNA沉默反防衛(wèi)機(jī)制、多數(shù)衛(wèi)星RNA在復(fù)制過程中伴隨著巨量的衛(wèi)星RNAsiRNA產(chǎn)生的三個(gè)依據(jù)，本文提出了以下假說

4、來解釋衛(wèi)星RNA減輕病毒對(duì)寄主植物所誘導(dǎo)的癥狀。1）病毒通過其產(chǎn)生的VSR干擾寄主植物的miRNA代謝途徑，從而致病;2）衛(wèi)星RNA通過其產(chǎn)生的巨量siRNA捕獲并飽和大部分的VSR，減少VSR干擾寄主植物的miRNA代謝途徑，減輕病毒對(duì)寄主植物誘導(dǎo)的癥狀。
　　 本文通過對(duì)煙草、輔助病毒CMV和Y-衛(wèi)星RNA(Y-Satellite RNA，Y-Sat)組成的模式系統(tǒng)進(jìn)行研究，驗(yàn)證了以上假說。模式系統(tǒng)選用CMV亞組Ⅱ的病毒株Q

5、-CMV作為負(fù)對(duì)照。Y-Sat被選用于本研究，是因?yàn)樾l(wèi)星RNA的研究中以對(duì)CMV衛(wèi)星RNA研究最多，而Y-Sat在CMV衛(wèi)星RNA中具有代表性，可以導(dǎo)致本氏煙和普通煙等的斑駁黃花，方便了對(duì)病毒侵染過程的檢測(cè)。
　　 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)方面，1）應(yīng)用GUS報(bào)告基因監(jiān)測(cè)在有無衛(wèi)星RNA伴隨侵染時(shí)P19和2b兩種VSR的活性;2）應(yīng)用miR168表達(dá)量易受VSR誘導(dǎo)的特性，監(jiān)測(cè)在有無衛(wèi)星RNA伴隨侵染時(shí)VSR對(duì)miR168的影響。驗(yàn)證實(shí)

6、驗(yàn)獲得了以下幾個(gè)方面的結(jié)果:
　　 1.hpGUS可以有效的沉默GUS，而TBSV的P19和SD-CMV編碼的2b兩個(gè)VSR構(gòu)件都可以干擾hpGUS介導(dǎo)的GUS沉默。實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)桿菌浸潤法將GUS+hpGUS、GUS+hpGUS+P19或2b等構(gòu)件轉(zhuǎn)入本氏煙中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，比較有無VSR共浸潤時(shí)GUS蛋白量的變化。并通過GUS染色和GUS的相對(duì)酶活性測(cè)定分析了P19和2b的活性。實(shí)驗(yàn)成功模擬了植物內(nèi)源的小RNA代謝途徑，檢驗(yàn)了P1

7、9和2b對(duì)hpGUS介導(dǎo)的GUS沉默的影響;實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以前報(bào)道的VSR可以干擾hpRNA介導(dǎo)RNA沉默的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。
　　 2.Y-Sat影響了VSR干擾RNA沉默的功能。在野生型本氏煙上進(jìn)行Q-CMV和Q-CMV+Y-Sat感染實(shí)驗(yàn)，然后瞬時(shí)表達(dá)GUS、hpGUS和P19或2b等構(gòu)件。在只有Q-CMV感染時(shí)，P19和2b都可以干擾hpGUS介導(dǎo)的GUS沉默;在Q-CMV+Y-Sat感染的樣品中，P19和2b對(duì)GUS的沉默卻

8、被削弱了;在只有GUS構(gòu)件時(shí)，存在GUS基因的共抑制現(xiàn)象（另一種RNA沉默形式）;在GUS+P19或GUS+2b共浸潤的樣品中，共抑制現(xiàn)象明顯減少，而在有Y-Sat感染時(shí)，即使有P19或2b構(gòu)件的存在，共抑制水平仍然很高。通過對(duì)GUSmRNA的Northem印跡分析，GUSmRNA的量與GUS蛋白的量正相關(guān)，證實(shí)了沉默發(fā)生在RNA水平。上述結(jié)果證明了Y-Sat能影響VSR干擾RNA沉默的功能，說明VSR對(duì)植物內(nèi)源小RNA介導(dǎo)的沉默途徑的

9、影響能被衛(wèi)星RNA削弱。
　　 3.Y-Sat導(dǎo)致的斑駁黃化對(duì)實(shí)驗(yàn)體系無明顯影響。CMV+Y-Sat共同侵染的本氏煙植株出現(xiàn)了斑駁黃化癥狀，影響了植物的正常光合作用，也可能對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系產(chǎn)生干擾。為了排除Y-Sat導(dǎo)致的斑駁黃化對(duì)實(shí)驗(yàn)體系的影響，實(shí)驗(yàn)用CHLI突變體mCHLI轉(zhuǎn)化本氏煙，獲得不再出現(xiàn)斑駁黃化植株。應(yīng)用mCHLI轉(zhuǎn)基因本氏煙F2代，進(jìn)行了Q-CMV或Q-CMV+Y-Sat的侵染，然后瞬時(shí)表達(dá)GUS、hpGUS和P1

10、9或2b、GFP等構(gòu)件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VSR影響了hpGUS介導(dǎo)的GUS沉默，在有Q-CMV+Y-Sat共侵染的樣品中，Y-Sat干擾了VSR的功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在野生型本氏煙中所得結(jié)果一致，說明了Y-Sat導(dǎo)致的斑駁黃化對(duì)實(shí)驗(yàn)體系無明顯影響。
　　 4.在Y-Sat感染且有GUS+hpGUS+VSR共浸潤的樣品中，GUS仍被高度沉默的現(xiàn)象不是由于hpGUS產(chǎn)生更多siRNA所致。在用GUS、hpGUS和P19或2b進(jìn)行共浸潤時(shí)，

11、Q-CMV+Y-Sat共同感染比Q-CMV單獨(dú)感染的樣品產(chǎn)生了更高水平的GUS沉默。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)有可能是由于Y-Sat干擾了VSR的功能，也有可能是由于hpGUS產(chǎn)生了更多的siRNA，從而介導(dǎo)了更多的GUS沉默。為了排除后一種可能性，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了hpGUSsiRNA的Northern印跡檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，在感染Q-CMV+Y-Sat樣品中，hpGUSsiRNA的量并沒有增加，排除了hpGUS產(chǎn)生更多siRNA介導(dǎo)更多的GUS沉默的可

12、能性。
　　 5.Y-衛(wèi)星RNAsiRNA捕獲了VSR，削弱VSR對(duì)hpGUS介導(dǎo)的GUS沉默途徑的影響。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用P19抗體進(jìn)行RNA-免疫捕獲分析，先對(duì)植株感染Q-CMV或Q-CMV+Y-Sat處理，再進(jìn)行GUS、hpGUS、P19共浸潤，后采用P19抗體沉淀P19蛋白復(fù)合體，并從沉淀復(fù)合體中分離RNA，通過Northern印跡分析與P19結(jié)合的hpGUSsiRNA、Y-SatsiRNA量。結(jié)果顯示，在Q-CMV感染的樣品中，

13、有部分hpGUSsiRNA與P19結(jié)合;而在Q-CMV+Y-Sat感染的樣品中，與P19結(jié)合的hpGUSsiRNA較少，大部分的P19和Y-SatsiRNA結(jié)合在一起。結(jié)果說明P19是通過結(jié)合hpGUSsiRNA來干擾hpGUS介導(dǎo)的GUS沉默;Y-SatsiRNA通過飽和VSR，增加游離的hpGUSsiRNA，介導(dǎo)了較高水平的GUS沉默。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明衛(wèi)星RNA是通過產(chǎn)生的大量siRNA捕獲VSR，從而削弱VSR對(duì)寄主小RNA介導(dǎo)

14、的對(duì)內(nèi)源基因調(diào)控的干擾。
　　 6.Y-Sat可以削弱CMV編碼的2b對(duì)miR168的誘導(dǎo)。miRNA在植物生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。有報(bào)道證實(shí)了VSR可以誘導(dǎo)miR168的表達(dá)量，miR168負(fù)調(diào)控AGO1mRNA，影響了植物miRNA代謝途徑中關(guān)鍵蛋白AGO1的量。為了證實(shí)VSR對(duì)植物內(nèi)源rniRNA的影響是病毒致病的主導(dǎo)因素，且衛(wèi)星RNA可以減少VSR對(duì)miRNA代謝的影響，本實(shí)驗(yàn)以miR168的表達(dá)量為指示，檢測(cè)

15、了感染CMV亞組Ⅱ(Q-CMV)和CMV亞組Ⅰ(Fny-CMV)及與Y-Sat的本氏煙樣品中miR168的表達(dá)量。結(jié)果顯示，Q-CMV和Fny-CMV都可以誘導(dǎo)miR168的表達(dá)量;當(dāng)有Y-Sat共同感染時(shí)，miR168的表達(dá)量明顯減少，感染植株癥狀減輕;Fny-CMV可以引起相對(duì)于Q-CMV而言更高的miR168累積，感染植株也產(chǎn)生了更嚴(yán)重的癥狀。結(jié)果說明Y-Sat可以削弱CMV編碼的2b對(duì)miR168的誘導(dǎo)，且miR168的表達(dá)量高

16、低與植物發(fā)病程度緊密相關(guān)。實(shí)驗(yàn)用半定量RT-PCR檢測(cè)CMVRNA4a，發(fā)現(xiàn)Y-Sat在削弱2b對(duì)miR168誘導(dǎo)的同時(shí)，編碼2b蛋白CMVRNA4a的量有輕微的減少，導(dǎo)致miR168表達(dá)量減少的原因部分可能是由于Y-Sat共同感染時(shí)2b量的減少。
　　 7.Y-Sat顯著的抑制了P1/HcPro對(duì)miR168的誘導(dǎo)。本文應(yīng)用了由煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus，TEV)編碼的VSRP1/HcPro轉(zhuǎn)基因普通煙

17、（N.tabacum）體系對(duì)miR168的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在P1/HcPro轉(zhuǎn)基因普通煙中，miR168被明顯的誘導(dǎo)，同時(shí)出現(xiàn)莖基部彎曲生長的表現(xiàn)型;在Q-CMV+Y-Sat共同感染轉(zhuǎn)基因普通煙中，miR168的表達(dá)水平顯著降低，莖基部彎曲生長的表現(xiàn)型基本消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，植物病毒VSR通過影響植物內(nèi)源的miRNA代謝途徑而致病，而衛(wèi)星RNA通過干擾VSR，削弱病毒的致病性，減輕病毒誘導(dǎo)的癥狀。
　　 以上

18、7個(gè)結(jié)論，從小RNA的水平驗(yàn)證了植物病毒衛(wèi)星RNA弱化輔助病毒致病機(jī)理的假說，證明了1）病毒通過其產(chǎn)生的VSR干擾寄主植物的miRNA代謝途徑，從而致病;2）衛(wèi)星RNA通過其產(chǎn)生的巨量siRNA捕獲并飽和大部分的VSR，減少VSR干擾寄主植物的miRNA代謝途徑，減輕病毒對(duì)寄主植物誘導(dǎo)的癥狀。
　　 衛(wèi)星RNA主要存在于植物病毒，DIRNA主要存在于動(dòng)物病毒。假說在植物和病毒衛(wèi)星RNA上面得到了部分驗(yàn)證，作者推斷假說還適用于動(dòng)物