利用侵染性cDNA研究甜菜壞死黃脈病毒RNA5與病毒致病性的關(guān)系.pdf

1、利用RT-PCR對來自新疆、黑龍江、寧夏、甘肅、河北省甜菜叢根病病田的各BNYVV分離物中RNA5組分進(jìn)行檢測,在來自于新疆、寧夏和黑龍江的分離物中發(fā)現(xiàn)有RNA5的存在,說明在中國發(fā)生的BNYVV分離物中廣泛存在RNA5組分.對新疆、寧夏和黑龍江分離物中的RNA5進(jìn)行克隆和序列分析后,與已報道的BNYVV日本D5分離物、法國的F72分離物以及中國內(nèi)蒙古發(fā)現(xiàn)的包頭分離物和呼和浩特分離物的RNA5的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行同源性比較.

2、結(jié)果表明,不同分離物RNA5核苷酸序列的同源性為93.0％~98.7％,變異主要集中在編碼蛋白啟始密碼子AUG前100個核苷酸的區(qū)域內(nèi).所有RNA5基因組都只包含一個開放閱讀框架(ORF),除法國的F72(編碼232個氨基酸)外,其它6個分離物都編碼228個氨基酸的多肽.各分離的氨基酸序列同源性為89.7％~98.7％.構(gòu)建了RNA5編碼蛋白的原核表達(dá)載體pETHu26,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在大腸桿菌中得到表達(dá),表達(dá)的融合蛋白包含載體編碼的

3、45個氨基酸和RNA5編碼的26kDa蛋白.用融合蛋白免疫家兔,制備了RNA5編碼蛋白的特異性抗血清,Western blot分析表明該血清可以用于BNYVV接種番杏葉片后RNA5編碼26kDa蛋白的檢測.分別構(gòu)建了T7啟動子和35S啟動子控制下的全長RNA5侵染性cDNA克隆,Northern blot檢測表明它們都具有侵染性.利用T7控制下的全長RNA5侵染性cDNA克隆pUCHu3的體外轉(zhuǎn)錄物與不含RNA5的BNYVV突變株,BN

4、YVV-Hu0和BNYVV-Hu3的RNAs混合接種番杏和甜菜,結(jié)果表明RNA5影響病毒侵染后寄主的癥狀表達(dá)和病毒在寄主內(nèi)的積累,并且和甜菜叢根病的發(fā)病程度及甜菜產(chǎn)量有關(guān).這些結(jié)果表明除了RNA3外,RNA5是另外一個與BNYVV致病性相關(guān)的因素.在全長RNA5侵染性克隆pUCHu3的基礎(chǔ)上構(gòu)建了4個RNA5編碼區(qū)缺失突變體和1個點突變體的侵染性克隆.經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后與BNYVV-Hu3的RNAs混合接種番杏,Northern blot檢測