SARS病毒RdRp基因的RNA干擾研究.pdf

1、本研究選擇SARS病毒的RdRp基因為RNAi的靶基因。我們首先設計了1種安全、高效而可靠的方法來合成該基因：根據(jù)DNA shuffling技術的原理和SARS病毒RdRp基因的序列，設計并合成了多條寡核苷酸片段，每個片段末端都兩兩互補，從而在PCR過程中相互延伸，最終精確地組裝成RdRp基因。所得基因的序列與預期設計完全吻合。 利用pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1載體構建了3類真核重組表達質粒，并以增強型綠色熒光蛋白作

2、為標記基因。構建的表達質粒包括：1)分別表達RdRp和EGFP基因的質粒：pcDNA-RdRp和pcDNA-EGFP 。轉染Vero E6細胞后，pcDNA-G可表達明顯的綠色熒光蛋白；2)表達RdRp和EGFP融合基因的質粒：pcDNA-GR和pcDNA-RG，pEGFP-CRl和pEGFP-CR2。轉染Vero E6細胞后，前2個質粒表達的蛋白質熒光較弱；后2個熒光很強，可用于瞬時表達研究；3)雙順反子表達質粒：以pcDNA3.1(

3、+)為骨架，引入IRES元件，構建了pcDNA-GIR和pcDNA-RIG。pcDNA-GIR在細胞中的熒光蛋白表達量較強，還可以整合到宿主細胞的基因組中用于建立穩(wěn)定的細胞株；pcDNA-RIG在細胞中的熒光蛋白表達非常弱。 對細胞轉染條件進行了優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)：1)本研究中的最佳轉染條件為：2μg超螺旋狀態(tài)的無內毒素型超純質粒DNA，DNA和轉染試劑的比例為1:5，轉染時細胞的匯合度為60-80％，DNA-轉染試劑復合物與細胞共

4、同孵育的時間為2-4 h；2)幾種細胞的轉染效率分別為：HEK293：85-90％；COS-7：75-80％；Hela：75-80％；Vero E6：10-15％；3)細胞株對G418的敏感性為：轉染后最初的篩選，Vero E6、HEK293和COS-7使用800 mg/L的G418，Hela細胞為900 mg／L；對于篩選出來的穩(wěn)定細胞株，Hela細胞用300 mg／L、其余3種用200 mg/L的G418來維持抗性。探索出通過手工分

5、選來建立細胞株的方法，并分別建立了Vero-EGFP、Vero-RdRp、Vero-GIR和293-GIR等4種細胞株。Vero-RdRp能單獨表達RdRp，可用于SARS病毒RdRp的真核細胞表達、純化和性質等的研究；Vero-EGFP可以為RNAi研究或轉染細胞時提供對照；Vero-GIR和293-GIR可用于研究siRNA對內源基因的干擾作用。 在上述所有結果的基礎上，進行了RdRp基因的RNAi研究。1)用體外轉錄法合成

6、siRNA，分別和質粒pEGFP-CRl共轉染Vero E6細胞，利用熒光顯微鏡計數(shù)法、熒光定量RT-PCR和流式細胞術分別對實驗進行分析，結果表明，各組siRNA的抑制效率分別為：siRl和siR2為85-90％，siR3和siR4為70-75％，sirl+siR2為95％，siGFP為80％，siNC為3％。2)用人U6啟動子構建了siRl、siR2和siGFP的siRNA表達盒，將它們和pEGFP-CRl共轉染HEK293細胞，4

7、8 h后的熒光顯微鏡觀察和分析表明，SEC有著明顯的抑制靶基因表達的作用，其效率和相應的siRNA一致。3)將siRl和siR2與pEGFP-CRl質粒以尾靜脈高壓注射法導入小鼠體內，用定量RT-PCR技術檢測了48 h后幾個重要器官中RdRp基因的表達，結果表明，siRNA在體內有著和細胞中相似的RNAi效果，而且同一種siRNA在不同的器官中作用效果一致。上述RNAi研究實驗數(shù)據(jù)表明，對SARS病毒RdRp基因的2個位點進行干擾，可

8、以獲得80-90％的抑制效率；同時干擾這2個位點，其抑制效率可進一步增加，達到95％左右。 本研究首先通過3套方案的探索和改進，最終建立了1種優(yōu)化的組裝基因的方法，用合成的寡核苷酸片段在無病毒的體系中組裝出完整的RdRp基因。隨后，將組裝的RdRp片段克隆到質粒pcDNA-3.1(+)中，獲得真核表達質粒pcDNA-RdRp，再經(jīng)測序證實，所獲得的RdRp基因與預期設計完全吻合，并與99株SARS病毒基因組中的相應序列10

9、0％同源，表明該片段是最理想的RNAi靶序列。 本研究利用pcDNA3.1(+)和pEGFP-C1載體共構建了3類真核重組表達質粒：1、分別表達RdRp基因和增強型綠色熒光蛋白基因的質粒：pcDNA．RdRp和pcDNA-EGFP(pcDNA-G)。轉染vero E6細胞后，經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察，pcDNA-G可表達非常明顯的綠色熒光蛋白，pcDNA-R無熒光；2、表達RdRp和EGFP融合基因的質粒：pcDNA-GR和pcDNA

10、-RG，pEGFP-CRI和pEGFP-CR2。轉染Veto E6細胞后，前2個質粒表達的綠色熒光蛋白均較弱，后2個質粒在Vero E6細胞中表達的綠色熒光蛋白均很強，但它們無法整合到宿主細胞的基因組中，可用于瞬時表達的研究；3、雙順反子表達質粒：以pcDNA3.1(+)為骨架，引入質粒plRESneo中的IRES元件，構建了pcDNA-GIR和IpcDNA-RIG。其中pcDNA-GIR在細胞中的熒光蛋白表達量較強，載體也可以整合到宿

11、主細胞的基因組中用于建立穩(wěn)定的細胞株，而pcDNA-RIG在細胞中的熒光蛋白表達非常弱。 限制酶切和PCR鑒定以及測序分析均表明，上述各個質粒與預期結果相符；各質粒轉染Vero E6細胞后，均能轉錄出預期大小的mRNA;經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察，各個質粒在Vero E6細胞中表達綠色熒光蛋白的強度由大到小為：pcDNA-G，pEGFP-CRI和pEGFP-CR2，pcDNA-GIR，pcDNA-GR，pcDNA-RG，pcDNA-R

12、IG。后3個載體表達綠色熒光蛋白較弱，不宜于在后續(xù)研究中應用。pcDNA-R無熒光。pEGFP-CRI和pEGFP-CR2可用于瞬時轉染，pcDNA-GR可用于穩(wěn)定表達。 檢測了幾種常用細胞株對G418的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)，轉染后最初的篩選，對于Vero E6、293和COS-7這3種細胞，使用800 mg／L的G418進行，Hela細胞使用900mg／L的G418；對于篩選出來的穩(wěn)定細胞株，Hela細胞用300 mg／L的G41

13、8、其余3種可用200 mg／L的G418來維持抗性。 建立了通過手工分選以建立細胞株的方法。該方法先離出單個靶細胞，由單細胞生長成1個克隆，再逐步擴大培養(yǎng)，直到獲得細胞株。根據(jù)該方法，分別用質粒pcDNA-G、pcDNA-R和pcDNA-GIR轉染Vero E6細胞，建立了Vero-EGFP、Vero-RdRp和Vero-GIR等3種細胞株；用質粒pcDNA-GIR轉染HEK293細胞，建立了293-GIR細胞株。 利

14、用體外轉錄系統(tǒng)合成了6條siRNA：4條針對SARS病毒RdRp基因，1條針對EGFP基因，1條和所有的EST序列都沒有同源性的siNC，用作RNAi實驗的負對照。這些siRNA為3’-端帶-UU突起的2l ntdsRNA，是哺乳動物細胞中最有效的siRNA的結構形式。用Cy3標記siRNA并轉染VeroE6細胞，發(fā)現(xiàn)其轉染效率遠遠高于質粒，說明在進行siRNA和質粒共轉染時，能導入質粒的細胞中基本都能同時導入siRNA，這為共轉染si

15、RNA和質粒以進行RNAi研究提供了一定參考。分別用這6條siRNA和融合表達質粒pEGFP-CRl共轉染’Vero E6細胞，通過熒光顯微鏡計數(shù)法判斷各RNAi組中EGFP表達受抑制的效率，隨后又應用熒光定量RT-PCR和流式細胞術分別對實驗進行分析，結果表明，3種方法可以取得比較一致的實驗數(shù)據(jù)，各組siRNA的抑制效率分別為：siRl和siR2為85.90％，siR3和siR4為70-75％，siRl+SiR2為95％左右，siGF

16、P為80％左右，siNC為3％左右。熒光顯微鏡計數(shù)法可以方便快捷、連續(xù)動態(tài)地對活細胞進i行觀察分析，而且實驗數(shù)據(jù)可靠，成為本研究中最主要的判斷RNAi效果的方法。 siRNA表達盒是另一種可用于RNAi研究的分子，它在導入哺乳動物細胞后，能轉錄出小的發(fā)夾結構RNA，進而誘導啟動RNm程序。本研究在上述實驗結果的基礎上，用人的u6啟動子構建了RNAi效果最好的siR．1和siR2的SEC以及siGFP的SEC，在人胚胎腎上皮來源的

17、HEK293細胞中，共轉染SEC和pEGFP-CR．1，48 h后的熒光顯微鏡觀察和分析表明，SEC有著明顯的抑制靶基因表達的作用，其效率和相應的siRNlA一致。 應用尾靜脈高壓注射法將siRl和siR2與質粒pEGFP．CRl一起導入小鼠體內，用定量RT．-PCR技術檢測了48 h后幾個重要器官中RdRp基因的表達，結果表明，siRNA在體內有著和細胞中相似的RNAi效果，而且同一種siRNA在不同的器官中有著很一致的作用效