靶向FMDV受體整聯(lián)蛋白β6亞基的siRNA抑制病毒復(fù)制的研究.pdf

1、目的:整聯(lián)蛋白是一種介導(dǎo)病毒侵入宿主細胞內(nèi)的細胞受體,在病毒粘附過程中發(fā)揮重要作用。本研究利用RNA干擾技術(shù),對口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease veirus,FMDV)受體整聯(lián)蛋白β6亞基的胞漿域進行修飾,抑制其表達,從而抑制病毒侵入宿主胞內(nèi)復(fù)制。這為后續(xù)抗口蹄疫轉(zhuǎn)基因豬的獲得奠定了基礎(chǔ)。
　　方法:以豬整聯(lián)蛋白β6亞基為目的基因設(shè)計7對siRNA干擾分子。根據(jù)siRNA的篩選原則,篩選出對β6受體基因具

2、有干擾作用的siRNA,并合成shRNA。構(gòu)建了7個干擾載體。將鑒定正確的干擾載體大提質(zhì)粒,并用乙醇沉淀的方法純化、濃縮質(zhì)粒。利用組織塊法和酶消化法分離懷孕32天的皮特蘭豬胚胎成纖維細胞,用20％FBSDMEM培養(yǎng)基于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。利用X-treme GENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑盒將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至豬胚胎成纖維細胞和BHK細胞中,通過熒光倒置顯微鏡觀察PEF細胞內(nèi)干擾質(zhì)粒綠色熒光蛋白的表達情況。利用實時定量(qRT-PCR)技

3、術(shù)對每個干擾載體進行效果驗證。將干擾效果好的載體酶切后,連接至PXL-EGFP-NEO整合載體上,大提質(zhì)粒,乙醇純化濃縮后轉(zhuǎn)染PEF細胞。對轉(zhuǎn)染后的細胞進行G418篩選,獲得純化后的PEF細胞,并大量擴繁。qRT-PCR檢測整合載體的抑制效果及病毒復(fù)制量,并進行攻毒檢測。
　　結(jié)果:在NCBI上搜索獲得豬整聯(lián)蛋白β6亞基的基因序列,其序列編號為EF432729,并將其與鼠源整聯(lián)蛋白β6亞基基因序列在DNAMAN上比較,其同源性為8

4、4.75%,而在靶區(qū)域的同源性為93.55%。針對靶區(qū)域設(shè)計合成了7對siRNA,并構(gòu)建了7個干擾載體,分別命名。通過測序獲得正確的干擾載體。大量提取干擾載體質(zhì)粒,并利用乙醇沉淀技術(shù)純化質(zhì)粒,并將其濃縮至3000ng/μL以上。分離得到的PEF細胞于F1代凍存,共72管,保存于液氮罐中。將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至F2代PEF細胞。通過對轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化,獲得相對較高的轉(zhuǎn)染效率。提取轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的PEF細胞RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,利用qRT-PCR

5、技術(shù)分析干擾質(zhì)粒抑制豬整聯(lián)蛋白受體β6亞基的表達情況,并篩選出pGsi-Z4干擾效果較好的質(zhì)粒,其干擾效果為91.7%。構(gòu)建具有較好干擾效果的整合載體,依據(jù)PXL-EGFP-NEO整合載體上neo抗性,利用G418篩選轉(zhuǎn)染后的PEF細胞,并大量擴繁。利用qRT-PCR分析整合載體的干擾效果。轉(zhuǎn)染后36h,其抑制細胞受體效果較好。進行攻毒實驗,并通過qRT-PCR分析病毒復(fù)制量。結(jié)果顯示,在攻毒后24h和36h,可以減少病毒的復(fù)制。

6、>　　結(jié)論:針對豬整聯(lián)蛋白受體β6亞基胞漿域設(shè)計siRNA,在PEF細胞內(nèi),最終獲得了干擾效果較好的pGsi-Z4載體,其能夠有效的抑制受體β6亞基基因的表達,減少了病毒侵入細胞內(nèi)的數(shù)量,從而發(fā)揮抑制病毒在胞內(nèi)大量復(fù)制的作用。在利用該載體阻斷BHK細胞β6基因表達時,pGsi-Z4的siRNA與靶位點存在一個堿基的差異,因此并不能達到較理想的效果。而pGsi-Z5與靶位點則完全同源,在BHK細胞內(nèi)可以發(fā)揮一定的抑制作用。構(gòu)建的整合載體在