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文檔簡介
1、目的:1.建立多房棘球絳蟲分泌蛋白數(shù)據(jù)庫。2.構(gòu)建棘球絳蟲蛋白芯片及篩選診斷抗原。3.制備及評價棘球絳蟲重組抗原。
方法:1.建立多房棘球絳蟲分泌蛋白數(shù)據(jù)庫:①通過檢索公開數(shù)據(jù)庫,建立多房棘球絳蟲全基因組蛋白質(zhì)序列本地數(shù)據(jù)庫。②利用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測多房棘球絳蟲分泌蛋白質(zhì)組。③利用Blast2GO和KAAS自動注釋軟件對分泌蛋白進(jìn)行注釋與分析。2.構(gòu)建棘球絳蟲蛋白芯片及篩選診斷抗原:①采用博奧Personal Arraye
2、rTM16芯片點樣儀將棘球絳蟲重組抗原蛋白作為備選抗原點至于環(huán)氧基玻片上制備蛋白芯片。②選用50份包蟲病病人血清和50份正常人血清篩選診斷抗原。⑨采用博奧LuxScan HT24掃描儀于λ=532nm波長處掃描讀取數(shù)據(jù)。④對數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)后利用Mev軟件制作抗原抗體反應(yīng)熱圖譜。3.制備及評價棘球絳蟲重組抗原:①采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對候選診斷抗原進(jìn)行表達(dá)和純化。②對重組抗原蛋白進(jìn)行ELISA評估。
結(jié)果:1.對目前公開的數(shù)據(jù)庫
3、進(jìn)行檢索并序列比對之后共采集到10780條有效多房棘球絳蟲全基因組蛋白質(zhì)序列。其中,共發(fā)現(xiàn)875條含有信號肽的蛋白序列,307條屬于膜結(jié)合蛋白;38條含糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl-phosphatidylinositol,GPI)錨定位點;12條定位于線粒體。最終獲得了含518條序列的多房棘球絳蟲分泌蛋白組,占全基因組編碼蛋白序列的4.8%(518/10780)。經(jīng)Blast2GO和KAAS軟件注釋分析后結(jié)果顯示分泌蛋白主要出現(xiàn)在
4、人類疾病、新陳代謝過程、環(huán)境信息處理、有機系統(tǒng)、細(xì)胞過程和遺傳信息處理通路上,其中有6條序列與寄生蟲感染直接相關(guān)。2.成功制備含188個無細(xì)胞麥胚表達(dá)的棘球絳蟲重組蛋白與陽性陰性參照點的蛋白芯片,經(jīng)血清篩選后(閾值≥2.0作為陽性陰性反應(yīng)臨界值),共獲得6個敏感性較高的潛在診斷抗原,分別是EgP9、EgP11、EgP22、EgP43、EgP44和EgP164,其敏感性依次達(dá)到74%(37/50)、44%(22/50)、20%(10/50
5、)、40%(20/50)、50%(25/50)、24%(12/50),特異性為98%(49/50)、100%(50/50)、100%(50/50)、100%(50/50)、100%(50/50)、100%(50/50)。3.采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對已篩選到的6個診斷抗原進(jìn)行大量表達(dá)與純化,其結(jié)果顯示:EgP9、EgP11、EgP22、EgP43、EgP164表達(dá)成功,其中EgP9/22/43/164以可溶形式表達(dá),EgP11為包涵體形
6、式表達(dá)。采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)方法對制備的重組抗原進(jìn)行初步評估,其結(jié)果顯示EgP9/11/22/43/44/164/HCF的敏感性分別達(dá)到83%(34/41)、56%(23/41)、88%(36/41)、49%(20/41)、68%(28/41)、83%(34/41)和100%(41/41),特異性分別達(dá)到96%(45/47)、96%(45/47)、98%(46/47)、96%(46/47)、96%(46/47)、94%(4
7、4/47)和98%(46/47)。對重組抗原EgP9/22/164/P43蛋白進(jìn)行大規(guī)模血清學(xué)評價,其敏感性依次達(dá)到42%(65/156),53%(82/156),50%(78/156)和73%(115/157),特異性為94%(89/95),96%(92/96),94%(90/96)和96%(92/96)。四個重組抗原的組合敏感性和特異性均達(dá)到了82%。重組抗原EgP9/43/164與其他蟲種之間的交叉反應(yīng)率明顯低于囊液粗抗原HCF。
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