田鼠巴貝蟲病分子調(diào)查及其診斷抗原高通量篩選.pdf

1、目的：
　　對中緬邊境地區(qū)發(fā)熱人群田鼠巴貝蟲（Babesia microti）感染情況調(diào)查及田鼠巴貝蟲病相關(guān)診斷抗原候選分子高通量篩選鑒定。
　　方法：
　　1）首先對2014年6～8月期間在中緬邊境地區(qū)收集的200份排除瘧疾感染發(fā)熱病人的全血血樣提取DNA，然后應(yīng)用基于田鼠巴貝蟲18srRNA序列與微管蛋白序列設(shè)計引物進行巢式PCR擴增和測序分析鑒定田鼠巴貝蟲感染情況。
　　2）基于田鼠巴貝蟲公共數(shù)據(jù)庫篩選分泌

2、蛋白、重復(fù)序列和PiroplasmaDB公開數(shù)據(jù)庫中部分田鼠巴貝蟲與惡性瘧原蟲、牛巴貝蟲同源序列篩選構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫，從田鼠巴貝蟲（Babesia microti ATCC PRA-99TM）感染的BALB/c小鼠血液中提取田鼠巴貝蟲RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以田鼠巴貝蟲cDNA為模板擴增目的基因片段。利用無縫克隆技術(shù)連接目的基因片段的擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pEU-His，經(jīng)過重組質(zhì)粒的鑒定，最后獲得含有目的基因片段的表達質(zhì)粒。利用試劑盒提取

3、重組質(zhì)粒后，采用麥胚無細胞蛋白表達體系進行表達，用western-blot技術(shù)分析鑒定出表達正確的蛋白。通過蛋白芯片技術(shù)用不同感染時期鼠血清對表達正確的蛋白進行高通量篩選。
　　結(jié)果：
　　1）在200份發(fā)熱病人巢式PCR檢測有2份病人全血經(jīng)兩種巢式PCR和測序分析鑒定為田鼠巴貝蟲感染，并經(jīng)進化序列分析為人獸共患型田鼠巴貝蟲株。
　　2）篩選222個目的基因片段構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫，PCR成功擴增了215個片段，無縫克隆成功

4、構(gòu)建了186個重組質(zhì)粒，麥胚無細胞蛋白合成系統(tǒng)成功表達了167個重組蛋白。以感染田鼠巴貝蟲的BALB/c小鼠不同時期血清為抗體，利用蛋白芯片技術(shù)從167個重組抗原中篩選出10個重組抗原，分別是：BmSP44、BmRS8、BmRS21、BmRS28、BmRS29、BmHP3
　　3、BmHP37、BmHP41、BmHP42和BmHP43。
　　結(jié)論：
　　在我國云南省中緬邊境地區(qū)存在可感染人和其他哺乳動物的田鼠巴貝蟲；用