巴貝斯蟲(chóng)病LAMP檢測(cè)方法的建立.pdf

1、巴貝斯蟲(chóng)是一類(lèi)經(jīng)蜱傳播,紅細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲(chóng),屬于復(fù)頂亞門(mén),由該類(lèi)寄生蟲(chóng)引起的牛的巴貝斯蟲(chóng)病(babesiosis)在世界上許多地區(qū)發(fā)生和流行,是引起熱帶和亞熱帶地區(qū)牛巴貝斯蟲(chóng)病的主要病原。我國(guó)已有14個(gè)省(區(qū))報(bào)道有本病存在,主要病原為牛巴貝斯蟲(chóng)(Babesia bovis)和雙芽巴貝斯蟲(chóng)(Babesia bigemina),?；荚摷纳x(chóng)病后,常出現(xiàn)貧血、精神沉郁、發(fā)熱、血紅蛋白尿、共濟(jì)失調(diào)等癥狀,嚴(yán)重時(shí)引起死亡,給畜牧業(yè)和國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成

2、巨大損失。所以對(duì)該病的研究就顯得十分重要。目前,檢測(cè)巴貝斯蟲(chóng)病的方法有血液樣品的血涂片鏡檢技術(shù),血清學(xué)檢查,一般PCR檢測(cè)技術(shù)等,但是這些方法存在低敏感性,交叉感染,假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn),而且有的方法儀器設(shè)備要求比較高,價(jià)格昂貴,如實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是Notomi等在2000年發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。作為一種靈敏的鏈置換技術(shù),它可以在恒溫條件下短時(shí)間內(nèi)將目的DNA從幾個(gè)拷貝擴(kuò)增到109-1010拷貝

3、。本研究以巴貝斯蟲(chóng)細(xì)胞色素b為靶基因,建立簡(jiǎn)單、高效、快速的巴貝斯蟲(chóng)屬及牛巴貝斯蟲(chóng)和雙芽巴貝斯蟲(chóng)種的LAMP檢測(cè)方法,該方法可用于動(dòng)物巴貝斯蟲(chóng)病的診斷,尤其對(duì)該病的早期診斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。從GenBank中獲得巴貝斯蟲(chóng)屬內(nèi)各個(gè)種的細(xì)胞色素b基因序列,應(yīng)用BLAST進(jìn)行比對(duì),找出保守區(qū)域,根據(jù)LAMP引物設(shè)計(jì)的原則,設(shè)計(jì)屬的特異性引物,建立了針對(duì)巴貝斯蟲(chóng)屬的細(xì)胞色素b基因的LAMP檢測(cè)方法。以牛的巴貝斯蟲(chóng)的細(xì)胞色素b基因?yàn)槟０?進(jìn)行L

4、AMP法擴(kuò)增,并將產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體后測(cè)序。結(jié)果表明,擴(kuò)增的目的片段大小為254 bp,與預(yù)期擴(kuò)增大小一致。該LAMP檢測(cè)體系的特異性強(qiáng),不能在牛瑟氏泰勒蟲(chóng)DNA、馬泰勒焦蟲(chóng)DNA、弓形蟲(chóng)DNA、羊泰勒焦蟲(chóng)DNA中擴(kuò)增出條帶;敏感性高,雙芽巴貝斯蟲(chóng)最低檢測(cè)的DNA含量為0.85 fg/μL,牛巴貝斯蟲(chóng)最低檢測(cè)的DNA含量為0.14 fg/μL。為了進(jìn)一步檢測(cè)巴貝斯蟲(chóng)種的分類(lèi),本研究建立了牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)種的LAMP檢測(cè)方法。根據(jù)

5、公布的牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)細(xì)胞色素b的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物,構(gòu)建牛巴貝斯蟲(chóng)病的LAMP檢測(cè)體系。對(duì)巴貝斯蟲(chóng)樣品進(jìn)行LAMP擴(kuò)增并將產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體后測(cè)序。結(jié)果表明,擴(kuò)增的目的片段符合預(yù)期的設(shè)計(jì)。該LAMP檢測(cè)體系的特異性強(qiáng)、敏感性高,牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)細(xì)胞色素b基因能夠檢測(cè)到的最低含量為0.085 fg/μL。該檢測(cè)體系的成功構(gòu)建為動(dòng)物感染牛巴貝斯蟲(chóng)病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支撐。針對(duì)牛巴貝斯蟲(chóng)病也是目前危害牛健康的主要常見(jiàn)

6、病,本研究還建立了牛巴貝斯蟲(chóng)種的LAMP檢測(cè)方法。根據(jù)公布的牛巴貝斯蟲(chóng)細(xì)胞色素b的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物,應(yīng)用LAMP方法對(duì)巴貝斯蟲(chóng)樣品進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行敏感和特異性檢測(cè)。結(jié)果表明,該LAMP檢測(cè)體系的敏感性高,牛巴貝斯蟲(chóng)細(xì)胞色素b基因能夠檢測(cè)到的最低含量為0.014 fg/μL。特異性較強(qiáng),除能擴(kuò)增出牛巴貝斯蟲(chóng)的特異性片段外,雙芽巴貝斯蟲(chóng)DNA、馬泰勒焦蟲(chóng)DNA、羊泰勒焦蟲(chóng)DNA等為模板都不能擴(kuò)增特異性條帶。該方法可用于牛感染牛巴貝斯蟲(chóng)