東方巴貝斯蟲TRAP2基因的克隆表達(dá)及其部分功能研究.pdf

1、東方巴貝斯蟲(Babesia orientalis)是1984年新發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的巴貝斯蟲新種，臨床研究表明其僅僅對(duì)水牛有較嚴(yán)重的致病性，并由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳遞，主要分布在我國長江以南的區(qū)域?；疾?dòng)物臨床表現(xiàn)為貧血、高熱、黃疸和血紅蛋白尿等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡，對(duì)我國南方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和水牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅。當(dāng)前，水牛巴貝斯蟲病的防治還是傳統(tǒng)的用藥物涂抹防治，治療效果很不理想，而臨床用于防控治療東方巴貝斯蟲病疫苗鮮有報(bào)道，對(duì)蟲體侵染宿主相關(guān)的

2、關(guān)鍵分子研究也不系統(tǒng)。
　　基于此，本研究選取已經(jīng)在頂復(fù)門類原蟲中確定的關(guān)鍵入侵分子TRAP蛋白為研究對(duì)象，從現(xiàn)有的東方巴貝斯蟲基因庫里釣取了東方巴貝斯蟲凝血酶敏感素相關(guān)無名蛋白2(Babesia orientalis Thrombospondin-related anonymous protein2，BoTRAP2)基因信息并進(jìn)行克隆與分析，并探索了BoTRAP2蛋白與水牛紅細(xì)胞膜蛋白的互作，BoTRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域在與肝素

3、的結(jié)合時(shí)的功能特點(diǎn)，最后對(duì)BoTRAP2蛋白晶體的形成也進(jìn)行了嘗試。
　　(1)東方巴貝斯蟲TRAP2基因的克隆、表達(dá)和生物信息學(xué)分析
　　通過序列比對(duì)在東方巴貝斯蟲全基因庫中查找到了一段和牛巴貝斯蟲TRAP2基因序列(XM_001609762.1)同源性極高的序列。設(shè)計(jì)特異性的引物在東方巴貝斯蟲全基因庫中擴(kuò)增到一條2817bp的片段，對(duì)該核苷酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其含有2段vWFA結(jié)構(gòu)域、2段TSP結(jié)構(gòu)域、1段MI

4、ADS結(jié)構(gòu)性域、1段橫跨膜結(jié)構(gòu)域，與典型的TRAP樣家族核苷酸結(jié)構(gòu)非常吻合，表明該基因序列為東方巴貝斯蟲TRAP2基因。同源性分析表明該氨基酸序列與牛巴貝斯蟲TRAP2氨基酸序列的同源性高達(dá)94％，生物信息學(xué)軟件分析表明該蛋白具有很好的抗原性。
　　(2)東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白和紅細(xì)胞膜蛋白的相互作用
　　選取TRAP2蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域（含有vWFA、TSP、MIADS關(guān)鍵序列區(qū)域）進(jìn)行截短表達(dá)，設(shè)計(jì)含有合適酶切位點(diǎn)特異

5、性的引物克隆TRAP2-vWFA-TSP，構(gòu)建含單一His標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP，轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)菌株中。經(jīng)過探索，在18℃、100rpm、IPTG濃度1.0mM、培養(yǎng)15h能得到高效表達(dá)在上清液的蛋白，通過鎳柱純化能獲得高純度的目的蛋白。Far-western驗(yàn)證重組TRAP2-vWFA-TSP蛋白與紅細(xì)胞膜蛋白的互作，結(jié)果顯示在紅細(xì)胞膜蛋白上有一條疑似目的條帶，表明東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白與

6、紅細(xì)胞膜表面的某一蛋白有一定的結(jié)合作用。
　　(3)東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域和肝素的粘附結(jié)合
　　分別構(gòu)建pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP、pET-28a-TRAP2-vWFA、pET-28a-TRAP2-TSP原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)菌株中，經(jīng)過探索，獲得了大量高純度的重組TRAP2-vWFA-TSP、TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP蛋白，通過ELISA驗(yàn)證TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域與肝

7、素的相互作用。結(jié)果顯示TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域與肝素都有很好的結(jié)合，并且TRAP2-vWFA-TSP蛋白與肝素的結(jié)合親和力強(qiáng)于單獨(dú)的TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP蛋白與肝素結(jié)合的親和力之和，這也表明了在TRAP2蛋白與肝素結(jié)合時(shí)其單個(gè)結(jié)構(gòu)域可能起著協(xié)同作用。
　　(4)東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白晶體的初篩
　　將純化后的截短pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白用型號(hào)為GE Superdx200pg分子篩

8、純化柱再次純化，依據(jù)分子篩的運(yùn)行圖得知pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白以二聚體復(fù)合物的形式存在，經(jīng)過分子篩純化濃縮后能得到蛋白濃度為9mg/mL、純度＞90％的目的蛋白，經(jīng)過商業(yè)化結(jié)晶板進(jìn)行初篩得到疑似蛋白晶體的小晶塊，通過改變Buffer緩沖液中的鹽離子、沉淀劑的濃度來進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)未得到理想的結(jié)果，需要進(jìn)一步摸索條件。
　　本課題成功克隆了東方巴貝斯蟲的TRAP2基因并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)