東方巴貝斯蟲棒狀體相關(guān)蛋白1(RAP1)基因克隆及免疫特性研究.pdf

1、東方巴貝斯蟲(Babesia orientalis，簡稱：B.o)是一種由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播的血液原蟲，主要引起水牛發(fā)病，臨床癥狀以高熱，貧血，黃疸，消瘦和血紅蛋白尿等為特征，嚴(yán)重時導(dǎo)致水牛死亡。東方巴貝斯蟲的發(fā)現(xiàn)到目前已經(jīng)有二十多年，盡管對其形態(tài)學(xué)、流行病學(xué)、生活史、分子分類和診斷技術(shù)等方面進行了詳細的研究，但關(guān)于該病原的入侵機制以及候選疫苗篩選等方面的研究仍然有限。因此，本研究在建立的東方巴貝斯蟲基因組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，克隆與蟲體入侵

2、相關(guān)的棒狀體相關(guān)蛋白1(RAPl)基因，對其進行氨基酸序列和進化分析，隨后對其進行原核表達及免疫熒光定位，從而為闡明東方巴貝斯蟲的入侵和免疫機制提供依據(jù)。
　　 (1)東方巴貝斯蟲RAP1基因克隆及其結(jié)構(gòu)預(yù)測
　　 根據(jù)從數(shù)據(jù)庫獲取的東方巴貝斯蟲RAP1基因的相關(guān)信息設(shè)計一對特異性的引物RAP1-F/RAP1-R，從東方巴貝斯蟲基因組擴增到一條1732bp的包含RAP1基因全長的序列?；蛐蛄蟹治霰砻髌浒粋€1434b

3、p的ORF，編碼477個氨基酸。同源性分析表明，此蛋白基因序列與羊巴貝斯蟲RAP1(Babesia ovis RAP1)基因(GenBank序列號：M91173.1)的第二個CDS序列同源性最高為71%；與牛巴貝斯蟲(Babesia bovis；AF030058.1)、駑巴貝斯蟲(Babesia caballi；AB017700.1)、犬巴貝斯蟲(Babesia canis；M91168.1)的同源性分別為68%、63%和64%。預(yù)測的

4、氨基酸序列與牛巴貝斯蟲(GenBank序列號：AAB84268.1)的同源性最高為58%；與羊巴貝斯蟲(AAA27805.1)、駑巴貝斯蟲(ADF30793.1)、犬巴貝斯蟲(AAA27807.1)的同源性分別為43%、48%和42%。RAP1氨基酸序列的進化分析表明東方巴貝斯蟲是歸屬于巴貝斯蟲的一個獨立的新種。結(jié)構(gòu)分析表明，它具有巴貝斯蟲RAP1基因家族所特有的一些氨基酸結(jié)構(gòu)特征，如N末端具有一個17個氨基酸的信號肽；四個保守半胱氨酸

5、殘基；十四個氨基酸保守基序；前300個氨基酸的一些保守的基序以及C末端的5個串連的重復(fù)區(qū)域等。
　　 (2)東方巴貝斯蟲RAP1原核表達、免疫定位及免疫反應(yīng)原性
　　 根據(jù)RAP1基因的序列結(jié)構(gòu)特點，其主要的預(yù)測功能位點都處在N末端的前三百個氨基酸內(nèi)，本研究將克隆的東方巴貝斯蟲RAP1開放閱讀框全長(RAP1-F)和N末端834bp片段(RAP-N)連接到原核表達載體pGEX-KG，成功的構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pGEX-KG

6、-RAP1-F和pGEX-KG-RAP1-N。利用原核表達所得的重組蛋白GST-RAP1-F和GST-RAP1-N免疫新西蘭白兔成功的制備了多克隆抗體。利用東方巴貝斯蟲感染水牛陽性血清的Western-blot分析表明，GST-RAP1-F和GST-RAP1-N都具有良好的反應(yīng)原性。間接免疫熒光實驗證明東方巴貝斯蟲RAP1定位在紅細胞內(nèi)的蟲體表面。
　　 本實驗成功的克隆了東方巴貝斯蟲RAP1基因，其基因序列與結(jié)構(gòu)預(yù)測分析為進一