牛紅細(xì)胞表面受體糖蛋白和東方巴貝斯蟲球狀體蛋白3基因的克隆表達(dá)及分析.pdf

1、東方巴貝斯蟲(Babesia orientalis)是一種由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播的血液原蟲，只引起水牛巴貝斯蟲病。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究證實(shí)東方巴貝斯蟲是一獨(dú)立新種。因?yàn)闁|方巴貝斯蟲只感染水牛，不感染黃牛和奶牛，推測(cè)可能與不同巴貝斯蟲入侵配體或不同種牛紅細(xì)胞受體的不同有關(guān)。由于東方巴貝斯蟲裂殖子入侵紅細(xì)胞的分子過(guò)程還不清楚，為從分子水平上尋找東方巴貝斯蟲僅感染水牛而不感染黃牛和奶牛的原因，本研究主要從東方巴貝斯蟲入侵相關(guān)的牛紅細(xì)胞受體與東方巴

2、貝斯蟲入侵相關(guān)配體兩方面進(jìn)行研究。
　　 1.牛紅細(xì)胞表面受體糖蛋白基因的克隆，分析與表達(dá)。
　　 (1)黃牛、奶牛和水牛紅細(xì)胞表面受體GYPC、DARC和GYPA基因的克隆及序列分析
　　 根據(jù)GenBank公布的牛Glycophorins C(GYPC)、Duffy antigen/chemokinereceptor(DARC)、Glycophorins A(GYPA)基因序列分別設(shè)計(jì)四對(duì)、兩對(duì)、六對(duì)特異性引

3、物，采用PCR方法分別從黃牛、奶牛和水牛全血基因組中擴(kuò)增得到GYPC、DARC、GYPA的基因片段，分別構(gòu)建克隆載體后測(cè)序鑒定。利用clustalx和PrimerPremier5.0拼接GYPC四個(gè)外顯子序列、DARC的兩個(gè)外顯子序列和GYPA的六個(gè)外顯子序列。利用DNAStar軟件預(yù)測(cè)黃牛、奶牛和水牛的GYPC、DARC和GYPA的親水性、抗原性、表面活性、等電點(diǎn)、一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)等，利用在線軟件預(yù)測(cè)跨膜區(qū)，糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽，并進(jìn)

4、行比較分析。結(jié)果表明水牛GYPC、GYPA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)，等電點(diǎn)，糖基化位點(diǎn)與數(shù)目與黃牛和奶牛的GYPC都有較大差異；黃牛、奶牛和水牛DARC的等電點(diǎn)，一級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)，等電點(diǎn)，跨膜區(qū)，糖基化位點(diǎn)都有差異。
　　 (2)黃牛GYPA基因的真核表達(dá)
　　 將人工合成的黃牛GYPA基因插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，并連接綠色熒光蛋白基因EGFP，pCDNA3.1(+)-GYPA-EGFP質(zhì)粒測(cè)序鑒定后，通

5、過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PK，MDBK細(xì)胞，24h時(shí)可以看到綠色熒光，36h時(shí)熒光最強(qiáng)。空白熒光對(duì)照質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-EGFP的熒光分布于細(xì)胞內(nèi)，pCDNA3.1(+)-GYPA-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后熒光分布在細(xì)胞膜周圍且熒光強(qiáng)度弱于空白熒光對(duì)照質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-EGFP，這是由于GYPA基因含有信號(hào)肽，蛋白質(zhì)表達(dá)后分泌到細(xì)胞表面，而且目的蛋白的表達(dá)降低了熒光蛋白的強(qiáng)度。
　　 總之，通過(guò)黃牛、奶牛和水牛GYPC、DA

6、RC和GYPA的克隆和序列比較分析，推測(cè)水牛GYPC、GYPA序列與黃牛、奶牛的差異較大，可能是東方巴貝斯蟲只感染水牛的原因，具有深入研究?jī)r(jià)值。
　　 2.東方巴貝斯蟲SBP3基因的克隆，序列分析，原核表達(dá)及免疫反應(yīng)性研究
　　 (1)東方巴貝斯蟲SBP3基因的克隆及序列分析
　　 利用本實(shí)驗(yàn)室東方巴貝斯蟲基因組測(cè)序結(jié)果和GenBank中相關(guān)的牛巴貝斯蟲SBP3基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，以含蟲全血基因組作為模板，通

7、過(guò)PCR擴(kuò)增獲得東方巴貝斯蟲的SBP3基因，測(cè)序結(jié)果顯示序列全長(zhǎng)為3237bp，為一個(gè)完整的開放閱讀框，推測(cè)出蛋白質(zhì)分子量為118kDa，含1079個(gè)氨基酸殘基?；蛐蛄型葱苑治龇治鼋Y(jié)果表明東方巴貝斯蟲與牛巴貝斯蟲SBP3(GenBank序列號(hào)：AF107117.1)序列同源性最高為70%，東方巴貝斯蟲SBP3比牛巴貝斯蟲基因序列少33bp，蛋白質(zhì)序列少11AA，進(jìn)一步說(shuō)明東方巴貝斯蟲是新種。利用DNAStar軟件中的Protean預(yù)

8、測(cè)東方巴貝斯蟲SBP3抗原決定簇，結(jié)果表明其具有良好的抗原性。
　　 (2)東方巴貝斯蟲SBP3的原核表達(dá)及免疫反應(yīng)性研究
　　 SBP3基因截短表達(dá)，分三段命名為SBP3-1，SBP3-2，SBP3-3，長(zhǎng)度分別為927bp，1329bp，1026bp。克隆入pET-28a(+)原核表達(dá)載體中，構(gòu)建pET-28a(+)-SBP3-1，pET-28a(+)-SBP3-2，pET-28a(+)-SBP3-3原核表達(dá)質(zhì)粒。將

9、構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21-CondonPlus，IPTG誘導(dǎo)HIS-SBP3融合蛋白表達(dá)。Western-blot檢測(cè)獲得40kD，53kD，42kD的目的帶，大小與蛋白理論預(yù)測(cè)值相符，表明SBP3重組蛋白與東方巴貝斯蟲病陽(yáng)性牛血清的天然抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明東方巴貝斯蟲SBP3具有很好的免疫反應(yīng)原性。
　　 本研究完成了東方巴貝斯蟲SBP3的克隆，原核表達(dá)，Western-blot，表明SBP3可作為潛在的免疫檢測(cè)和