東方巴貝斯蟲EST序列分析及其線粒體基因的測(cè)定.pdf

1、東方巴貝斯蟲（Babesia orientalis）是一種經(jīng)鐮形扇頭蜱傳播的重要血液原蟲，是由本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)并命名的一個(gè)巴貝斯蟲新種，主要引起水牛巴貝斯蟲病。該病在我國(guó)長(zhǎng)江以南許多省份發(fā)生和流行，臨床上患病牛以高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿等為特征，甚至引起死亡，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 本研究首先利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的Babesia orientalis cDNA文庫，進(jìn)行了B．orientalis EST序列的測(cè)定和分析，并對(duì)所得

2、的EST序列結(jié)果進(jìn)行電子克隆延伸，針對(duì)EST的分析結(jié)果和延伸結(jié)果，選取線粒體基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，并進(jìn)一步構(gòu)建了細(xì)胞色素b基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。
　　 （1）B．orientalis EST序列的測(cè)定和分析
　　 從B．orientalis cDNA文庫中隨機(jī)挑取噬菌斑，轉(zhuǎn)染Bm25.8，經(jīng)PCR鑒定后將插入片段大于300 bp的陽性克隆子測(cè)序，共測(cè)定了1514條B．orientalis EST序列，對(duì)有效EST序列運(yùn)用phr

3、ap等軟件進(jìn)行拼接，聚類后BLAST分析，得到1171個(gè)同源性較高的unigene，這些基因分別為：線粒體基因、RNA結(jié)合蛋白、類紅細(xì)胞表面抗原、類裂殖體表面抗原、代謝相關(guān)的磷酸酶及蛋白酶、衰老相關(guān)蛋白、核糖體蛋白、熱休克蛋白70、類熱休克蛋白90、肌動(dòng)蛋白、鋅指蛋白、cGMP依賴蛋白激酶等基因的部分或全基因及功能未知的假定蛋白（hypothetical protein）基因部分或全基因；并且推測(cè)出共計(jì)5條可能的代謝途徑，包括氧化磷酸化

4、代謝途徑、核糖體途徑、細(xì)胞因子受體途徑、細(xì)胞凋亡途徑、抗體加工及呈遞途徑等多種代謝途徑。
　　 （2）B．orientalis EST序列的電子克隆延伸和分析
　　 對(duì)所得的1514條EST序列逐條進(jìn)行電子克隆延伸，其延伸長(zhǎng)度由原來EST序列平均長(zhǎng)度的593.7 bp延長(zhǎng)至819 bp，延長(zhǎng)了約1.4倍。83條可能的新基因中，與原蟲具有同源性的基因數(shù)有15條，另外有69條EST序列與原蟲有關(guān)，對(duì)其中51條進(jìn)行了完全電子克

5、隆的延伸。
　　 （3）B．orientalis線粒體基因的克隆、測(cè)序和生物信息學(xué)分析
　　 根據(jù)獲得的EST序列分析結(jié)果和電子克隆分析結(jié)果，選取了轉(zhuǎn)錄豐度非常高的線粒體基因作進(jìn)一步研究，其編號(hào)為Contig18，設(shè)計(jì)特異引物對(duì)這條候選序列各基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，只有少部分由于線粒體的自身特點(diǎn)無法測(cè)序得到，從而證實(shí)了電子克隆的有效性。同時(shí)還對(duì)線粒體上的各個(gè)基因做了分析，并對(duì)細(xì)胞色素b基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，并結(jié)合原蟲的18