狂犬病毒核蛋白和糖蛋白基因的克隆、表達、純化及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的人畜共患傳染病，發(fā)病后幾乎全部以死亡而終。本研究旨在用免疫信息學和重組表達技術(shù)制備特異性診斷重組蛋白，并建立ELISA快速檢測狂犬病毒抗體水平的方法。 狂犬病病毒為彈狀病毒科，狂犬病病毒屬，基因組分別編碼核蛋白(NP)、轉(zhuǎn)錄酶蛋白(LP)、基質(zhì)蛋白(MP)、磷酸化蛋白(MS)和糖蛋白(GP)。其中，糖蛋白可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，核蛋白是最保守的具有免疫原性的

2、結(jié)構(gòu)蛋白。 本研究根據(jù)文獻中狂犬病病毒核蛋白(NP)與糖蛋白(GP)基因保守序列設(shè)計引物，從狂犬病疫苗未知滅活毒株中提取病毒RNA，通過一步法RT-PCR獲得糖蛋白與核蛋白基因的全長，亞克隆至原核表達載體pET-His中，轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta<'TM>(DE3)，IPTG誘導表達。菌體裂解物經(jīng)SDS-PAGE分析，分別得到53KD、60KD的蛋白，與預期相符。Western印跡檢測表明， NP、GP重組蛋白可被抗狂犬

3、病血清識別。通過Ni-NTA純化NP、GP包涵體，并采用間接酶聯(lián)免疫吸附方法(IELISA)對NP、GP純化蛋白特異性進行鑒定后表明：NP重組蛋白可有效地區(qū)分陽性血清與陰性血清。以NP為抗原，通過對其最佳稀釋度、靈敏度、特異性、重復性和穩(wěn)定性的檢測，建立起狂犬病毒血清水平的間接ELISA檢測。本實驗用基因工程方法表達的病毒蛋白作為檢測抗原，可以在短的時間內(nèi)生產(chǎn)出大批高純度的檢測抗原，大大降低了檢測的成本：與常用的用滅活病毒做包被抗原相比