IBDV-VP2基因部分片段的克隆與表達(dá)及其鑒定.pdf

1、傳染性法氏囊病是由傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起雞和火雞的一種急性、高度接觸性傳染病。自1957年Cosgrove首次報(bào)道該病以來，便出現(xiàn)世界性的流行特點(diǎn)，相繼流行于三十多個(gè)國(guó)家，尤其在養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)，1979年傳入我國(guó)北京、廣州、上海等地區(qū)，隨后發(fā)生于全國(guó)各地，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，盡管我國(guó)投入了大量的人力、物力，采取了控制與撲滅該病的措施，但由于超強(qiáng)毒株和變異株的出現(xiàn)，傳染性法氏囊病迄今仍然是威脅養(yǎng)禽業(yè)的頭號(hào)傳染病。 傳

2、染性法氏囊病毒主要侵害3-12周齡的雛雞和青年雞，破壞法氏囊中的B淋巴細(xì)胞，引起免疫抑制，因此，很容易和其它疾病聯(lián)合感染，出現(xiàn)亞臨床癥狀，給臨床診斷帶來不便。 為了建立一個(gè)準(zhǔn)確快速的診斷方法，分析我國(guó)目前使用的疫苗株的抗原基因是否發(fā)生了變異，本研究初步建立了檢測(cè)IBDV的RT-PCR方法、獲得了VP2蛋白的抗原決定區(qū)域的基因，構(gòu)建了該基因的重組質(zhì)粒，并且成功表達(dá)了VP2基因的部分片段。 首先，根據(jù)Gen Bank中已登錄

3、的傳染性法氏囊病毒VP2基因序列和在前人研究成果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了含酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基的一對(duì)引物，P<,1>：5′-CGGAATTCACAGGGCTAAT-3′；P<,2>：5′-GCGTCGACTGCTAGTTCAGGATTTGG-3′。以弱毒疫苗滅菌生理鹽水稀釋液為毒種，SPF雞胚接種法增殖IBDV病毒，再以在雞胚上已盲傳三代的尿囊液接種雞胚成纖維細(xì)胞，分別以尿囊液和細(xì)胞液離心后的沉淀物為材料，采用Trizol試劑法提取病毒的總RN

4、A，進(jìn)行RT-PCR，實(shí)驗(yàn)證明以尿囊液和成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液離心后的沉淀物提取的病毒總RNA均可作為RT-PCR的模板，均能夠擴(kuò)增出大小為987bp的基因片段(記為P<,12>)，與預(yù)期的結(jié)果一致。利用DNAStar軟件分析已登錄序列片段中的酶切位點(diǎn)，經(jīng)單酶切鑒定后，將其插入到質(zhì)粒載體PET-32a上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆和質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定后測(cè)序。序列分析表明，P<,12>與登錄號(hào)為．DQ202329、AY32

5、1509的中國(guó)毒株的同源性分別為99.8％、99.2％，與登錄號(hào)為AJ621158、AJ577092、和AF508177的國(guó)外毒株的同源性分別為97.3％、99.3％、和94.8％，這表明本實(shí)驗(yàn)已成功地?cái)U(kuò)增了目的基因，為建立檢測(cè)IBDV的RT-PCR方法奠定基礎(chǔ)。 其次，根據(jù)GenBank中登錄的傳染性法氏囊病毒基因序列及原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了另一條原核表達(dá)引物，P<,3>：5′-GCGTCGACCT

6、GTGATGAGAATTGGT-3′。為了便于基因的克隆與表達(dá)，我們?cè)谝锏?’端添加了酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基。以己構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板，P<,1>、P<,3>分別為上下游引物，擴(kuò)增504bp的原核表達(dá)目的片段(記為P<,13>)，將其插入到表達(dá)載體PGEX-4T-1上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆、雙酶切鑒定后，將抽提的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL<,21>，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)后，所表達(dá)的蛋白大小